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棉铃虫等鳞翅目害虫危害作物，造成严重经济损失。长期使用化学杀虫剂防治害虫产生诸多问题，亟需改进防治策略。其中，基于天敌致死宿主机理的研究不仅为天敌应用奠定了基础，而且促进了新型杀虫剂的开发。 中华卵索线虫是专性寄生鳞翅目害虫的病原线虫，极具生防潜力。迄今，关于线虫成功寄生并致死宿主的机理尚不清楚。早期研究发现，寄生因子介导天敌攻克宿主免疫防御、操纵宿主发育、调节宿主营养、形成氧化损伤并最终致死宿主。 据此，本研究建立中华卵索线虫——棉铃虫体系，以宿主生理应答(免疫、发育、营养、氧化应答)为切入点探索线虫的作用靶点。进一步鉴定线虫寄生因子(丝氨酸蛋白酶)并做功能验证。本研究采取正向推导和反向验证策略，旨在揭示线虫成功寄生并致死宿主的机理，为新型杀虫剂的开发提供靶点与先导化合物。具体结果如下: 1、线虫诱导血细胞凋亡，抑制宿主免疫 为探究线虫如何克服宿主的免疫防御，本研究比较分析宿主血细胞结节、延展、溶菌酶活力、黑化反应等显示，线虫抑制宿主免疫应答。随后，转录分析信号转导途径基因关键基因(HaPGRP、HaIiP、HaSep、HaPPO、HaLys及HaSRP)显示，宿主24h内对抗线虫，72h被线虫攻克。此外，分析线虫免疫抑制策略发现，线虫不抑制免疫效应分子，但抑制宿主血细胞增长。进一步流式细胞术分析显示，线虫寄生24h内诱导宿主血细胞大量凋亡，72h后无血细胞存活。体内、外存活显示，低温抑制血细胞增长后，线虫存活率提高。这些结果表明，线虫诱导血细胞凋亡，抑制宿主免疫。 2、线虫抑制JHE，阻滞宿主发育 为理解线虫如何操纵宿主的发育，本研究观测宿主虫龄、虫态及体重等形态学参数发现，线虫寄生3天后阻滞宿主发育。进一步，高效液相色谱(HPLC)测定显示，线虫寄生3天后不影响宿主蜕皮激素(20E)，但提高保幼激素(JHⅢ)滴度。随后，转录分析JH和20E信号转导途径关键基因(HaMet、HaECR、HaUSP、HaBR、HaKr-hi及HaE75)显示，宿主发育阻滞与JH相关，体外也得以验证。此外，探索线虫调控宿主JH的策略发现，线虫不分泌JH，也不影响宿主JH的合成，但抑制宿主保幼激素酯酶(JHE)。这些结果表明，线虫抑制JHE阻止JH的降解来阻滞宿主发育。 3、线虫摧毁中肠，掠取宿主营养 为明确线虫如何竞争宿主营养，本研究观测发现，线虫寄生3天后快速发育，同时抑制宿主取食、蛋白合成以及消化酶调控基因(HaTry、HaAmy1、HaAmy2、HaChy4及HaLPS)的表达。进一步，组织分析显示，线虫寄生3天时摧毁宿主中肠。然而，线虫的寄生提高了宿主淀粉酶和蛋白酶的活力。并且，相关分析显示，线虫淀粉酶和蛋白酶与宿主同步正相关。这些结果表明，线虫摧毁中肠，掠取宿主营养，而且可能利用消化酶来调节宿主。 4、线虫水解蛋白，致死宿主 为探明宿主致死是否涉及氧化损伤，本研究分析致死期超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)、过氧化氢酶(POD)、谷胱甘肽转移酶(GST)的酶活力及其基因表达发现，线虫寄生3天时，宿主SOD和POD活力及其基因表达提高，致6.75％的宿主死于黑化;93.25％的宿主于寄生7天后随线虫脱出死亡，其SOD、POD、CAT、GST活性及基因表达均显著提高，表明宿主死亡涉及氧化损伤。进一步分析丙二醛(MDA)和蛋白羰基含量发现，宿主MDA含量下降，但蛋白羰基却显著提高。这些结果表明，线虫水解蛋白形成氧化损伤，致死宿主。 5、线虫Os-sp和Os-sp56的克隆与功能分析 为探索线虫寄生介导因子，本研究从其转录组中鉴定丝氨酸蛋白酶基因Os-sp和Os-sp56。序列分析与比对结果显示，Os-sp和Os-sp56为胰蛋白酶。Os-sp和Os-sp56均在线虫寄生期表达。棉铃虫血细胞和中肠诱导Os-sp表达，而脂肪体与中肠诱导Os-sp56表达。进一步，构建pET-32a表达载体，在E.coli中原核表达，获得重组蛋白rOs-SP和rOs-SP56。功能分析显示:①rOs-SP凋亡棉铃虫血细胞并抑制酚氧化酶活力;②rOs-SP56抑制棉铃虫JHE活性，阻滞发育;③rOs-SP可摧毁棉铃虫中肠;④Os-SP和rOs-SP56均能产生蛋白羰基，致死棉铃虫，LC50分别为28ng与96ng(五龄幼虫)。这些结果表明，丝氨酸蛋白酶是一个寄生介导因子。 综上，本研究先通过宿主生理应答发现，线虫诱导宿主血细胞凋亡、抑制宿主JHE、摧毁宿主中肠以及水解蛋白，最终致死宿主。进一步，从线虫中鉴定丝氨酸蛋白酶，重组蛋白功能分析发现，rOs-SP和rOs-SP56分别能作用于宿主的以上靶点，表明丝氨酸蛋白酶介导线虫寄生。本研究初步探究了线虫成功寄生并致死宿主的机理，不仅为线虫应用奠定了基础，而且为新型杀虫剂的开发提供了靶点和先导化合物。