【摘 要】
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自交不亲和性（self-incompatibility,SI）是植物经长期进化形成的有效限制自交、促进杂交的遗传机制。芸薹属植物表现为孢子体自交不亲和性。近年来,虽然人们在以甘蓝为代表的芸薹属植物中SI信号传导机理研究方面取得了明显进展,但对分离和鉴定S-位点受体激酶（S-locus receptor kinase,SRK）下游信号元件的相关研究要相对缓慢。ARC1（ARM repeat cont
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自交不亲和性（self-incompatibility,SI）是植物经长期进化形成的有效限制自交、促进杂交的遗传机制。芸薹属植物表现为孢子体自交不亲和性。近年来,虽然人们在以甘蓝为代表的芸薹属植物中SI信号传导机理研究方面取得了明显进展,但对分离和鉴定S-位点受体激酶（S-locus receptor kinase,SRK）下游信号元件的相关研究要相对缓慢。ARC1（ARM repeat containing 1）是一个具有E3泛素化连接酶活性的U-box蛋白,在甘蓝SI信号传导途径中,ARC1作为SRK下游靶蛋白促进SI的发生。然有研究发现,反义抑制琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）和甘蓝型油菜（Brassica napus）ARC1基因表达,以及在甘蓝型油菜中过表达Exo70A1基因,材料的自交不亲和性均部分被打破。由此表明ARC1是SRK唯一下游底物存在质疑,或者可能存在除ARC1-Exo70A1以外的其他信号元件和信号通路参与调控SRK下游信号传导。基于此,本研究以两种高度自交不亲和甘蓝“A4”和“F1”为材料,经分析自花授粉、异花授粉后柱头转录组差异表达的情况,筛选出自交不亲和性相关基因,克隆其c DNA序列,进而以生物信息学分析、GUS启动子活性分析、原核表达、亚细胞定位、q RT-PCR及酵母双杂交等技术研究其功能。获得主要研究结果如下:1、甘蓝SRK互作蛋白编码基因BoPUB3L的克隆与分析利用甘蓝授粉后的柱头转录组数据分析,获得一个甘蓝自花授粉后差异表达的植物泛素蛋白家族成员基因BoPUB3L。BoPUB3L基因CDS全长为2214bp,编码737个氨基酸,理论等电点为6.04,分子量为81.27k Da,不含信号肽和跨膜域,含有5个臂重复ARM结构域和1个U-box结构域。BoPUB3L基因启动子中含有胁迫反应、激素反应、代谢调节、胚乳发育等多种顺式作用元件。BoPUB3L蛋白定位在细胞核。BoPUB3L基因的组织定量显示在甘蓝的根、叶、花和果荚中均有表达,且在柱头中表达量高于其他组织,与GUS染色结果基本一致。通过酵母双杂交实验发现BoPUB3L蛋白与SRK胞内域具有相互作用。利用基因超表达技术将甘蓝BoPUB3L基因转化到哥伦比亚生态型（Columbia,Col）拟南芥,发现过表达拟南芥植株能够正常生长,但长势弱小。以上研究结果为进一步研究BoPUB3L基因的功能奠定了基础,对深入了解自交不亲和机理具有重要意义。2、甘蓝自交不亲和相关基因BoGST21的克隆与表达分析从甘蓝自花授粉0-60min柱头转录组数据中,成功筛选出受自花授粉诱导上调表达的谷胱甘肽-s-转移酶基因BoGSTL21。BoGSTL21基因开放阅读框长度为900bp,编码299个氨基酸,理论等电点为8.49,不包含信号肽和跨膜区,含有GST-N和GST-C结构域,是GST-Lambda家族成员,与甘蓝型油菜的GST亲缘关系最近。BoGSTL21基因启动子中含有光响应、生长素应答、低温和干旱响应等多种顺式作用元件。BoGSTL21基因的组织定量结果和GUS染色结果基本一致,在不同组织中都有表达,在花的发育阶段,于成熟的柱头中高表达。荧光定量PCR结果显示,BoGSTL21基因在自花授粉后表达趋势为先上调后下调,异花授粉后变化不大,与转录组分析结果一致。通过酵母双杂交发现,BoGSTL21蛋白与花粉发育相关蛋白BoFAB1C、生长素相关的蛋白BoPATL2、醛缩酶型TIM桶家族蛋白BoF9N12＿9存在相互作用。BoGSTL21基因在大肠杆菌中被成功诱导表达,纯化蛋白大小为34k Da。本研究结果初步证明了谷胱甘肽-S-转移酶很可能参与SI甘蓝自花授粉过程,推测BoGSTL21很可能是参与SI反应过程的新蛋白,这为甘蓝自交不亲和的深入研究提供了新内容。
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