论文部分内容阅读
目的:1动态观察非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）小鼠肝脏脂肪变及肠道黏膜屏障功能的变化,初步探讨肠肝轴在NAFLD中的作用;2予白藜芦醇灌胃进行干预,观察内毒素水平、肠道菌群、肠黏膜屏障和炎症的变化,初步探讨该药物是否通过肠肝轴在NAFLD中发挥治疗作用。方法:1按照随机数字表将SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分组。48只雄性C57BL/6小鼠,6-8周龄,自由摄食AIN93对照饲料7天后,按照1:1比例随机分为正常对照组（NG,n=24）、模型组（MG,n=24）,分别给予对照饲料加正常饮水、高脂饲料加高糖饮用水（42g/L）即西方饮食（Western diet）,每组分为4、10、18、24周4个时相点,每个时相点随机分配6只动物,正常对照组分别记为NG4、NG10、NG18、NG24;模型组分别记为MG4、MG10、MG18、MG24。另取18只雄性C57BL/6小鼠,6-8周龄,自由摄食AIN93对照饲料7天后,按照1:2比例随机分为正常对照组（NG,n=6）、模型组（MG,n=12）,分别给予对照饲料加正常饮水、高脂饲料加高糖饮用水（42g/L）,造模24周后,正常对照组6只小鼠给予羧甲基纤维素（Carboxymethylcellulose sodium,CMC）45mg/kg/day灌胃,标记为NG+CMC组,模型组12只小鼠,随机分为2组,每组6只,分别给予白審芦醇（Resveratrol,Res）及CMC45mg/kg/day灌胃,分别标记为MG+Res组、MG+CMC组;6周后处死小鼠,并留取标本行相应检测。2定期观察小鼠的进食、精神状态及毛发光泽度等,每周测量小鼠体重并记录。3观察各组小鼠肝脏外形变化,记录肝重,计算并比较肝重指数。4应用苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,HE）染色观察肝组织及末端回肠黏膜病理学的改变。5检测各组血清甘油三酯（Triglyceride,TG）、血清总胆固醇（Total Cholesterol,TC）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）及丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）的变化情况,采用鲎试剂法测定内毒素水平。6 应用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitation PCR,Real-time qPCR）方法检测各组小鼠肝组织中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor,TNF-α）mRNA及小鼠回肠组织中Occludin mRNA、TNF-αmRNA的表达情况。7应用蛋白免疫印迹（Western Blot）方法检测各组肝脏组织中TNF-α蛋白及小鼠回肠组织中Occludin、TNF-α蛋白的表达情况。8应用16s rRNA宏基因组测序的方法了解白藜芦醇干预后小鼠肠道菌群的变化情况。结果:1实验动物的体重、肝重指数比较1.1与NG4组比较,MG4组小鼠体重无显著性差异（P>0.05）;与NG4组比较,MG4组小鼠肝重指数稍增加（P＜0.05）。1.2 MG10、MG18、MG24组分别较同一时期NG10、NG18、NG24组体重及肝重指数显著升高（P＜0.05）。1.3MG+Res组较MG+CMC组小鼠体重、肝重指数下降（P＜0.05）,但仍明显高于NG+CMC组（P<0.05）。2肝脏组织病理学改变HE染色显示,正常对照组各观察时间点小鼠肝脏肝小叶结构完整且排列规则,肝细胞形态正常,未见脂滴及炎性细胞;MG4组小鼠肝脏中少数肝细胞胞质疏松及少量脂滴沉积,肝细胞脂肪变比例<5%;MG10组肝脏中肝细胞部分胞质疏松呈空泡状及较多的脂滴沉积,肝细胞脂肪变比例约为30%-50%;MG18组肝脏大部分肝细胞内充满脂滴,肝细胞脂肪变比例约为50%-80%;MG24组肝脏广泛弥漫性肝细胞脂肪变,脂质内充满大量较大的脂肪空泡,肝细胞脂肪变比例>80%。MG+Res组较MG+CMC组肝脂肪变程度明显减轻。3回肠组织病理学改变对照组各观察时间点小鼠末端回肠黏膜结构完整,绒毛排列整齐规则,未见缺损;模型组中MG4组小鼠回肠组织病理与正常对照组比较无明显区别;MG10组小鼠回肠组织绒毛排列疏松紊乱;MG18、MG24组小鼠回肠组织部分绒毛萎缩缺损断裂,上皮层与固有层部分出现分离,病变程度逐渐加重。应用白藜芦醇治疗后,MG+Res组肠道黏膜损伤情况较MG+CMC组稍减轻。4 血清 ALT、AST、TG、TC、LPS 4.1 MG4、MG10、MG18、MG24 组分别较同一时期 NG4、NG10、NG18、NG24组血清ALT、AST及内毒素水平显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;MG4组与NG4组相比,血清TG、TC无明显区别（P>0.05）;MG10、MG18、MG24组分别较同一时期NG10、NG18、NG24组血清TG、TC显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。4.2 Res 治疗之后,MG+Res 组较 MG+CMC 组小鼠 ALT、AST、TG、TC和内毒素水平显著降低（P<0.05）,但仍显著高于NG+CMC组（P<0.05）。5 TNF-α mRNA与蛋白在肝脏组织的表达情况与NG24组比较,MG24组肝脏TNF-α mRNA与蛋白表达显著增高,差异有统计学意义（P＜0.05）。MG+Res组较MG+CMC组小鼠肝脏TNF-αmRNA与蛋白表达显著降低（P<0.05）,但仍显著高于NG+CMC组（P<0.05）。6 TNF-α、OccludinmRNA与蛋白在回肠组织的表达情况6.1与NG24组比较,MG24组肠道TNF-αmRNA与蛋白表达显著增高,差异有统计学意义（P<0.05）。MG+Res组较MG+CMC组小鼠肠道TNF-αmRNA与蛋白表达显著降低（P<0.05）,但仍显著高于NG+CMC组（P<0.05）。6.2与NG24组比较,MG24组肠道OccludinmRNA与蛋白表达显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。MG+Res组较MG+CMC组小鼠肠道Occludin mRNA与蛋白表达显著增高（P<0.05）,但仍明显低于NG+CMC组（P<0.05）。7 16s rRNA宏基因组分析结果7.1 Res治疗之前:MG组较NG组增多的有:厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、微菌门（Verrucomicrobia）和变形菌门（Proteobacteria）,差异有统计学意义（P<0.05）;MG组较NG组减少的有拟杆菌（Bacteroidetes）,差异有统计学意义（P<0.05）。7.2 Res治疗之后:MG+Res组较MG+CMC组增多的有拟杆菌（Bacteroidetes）,差异有统计学意义（P<0.05）。MG+Res 组较 MG+CMC组减少的有:厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和变形菌门（Proteobacteria）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1通过采用经典的西方饮食,成功建立了 NAFLD小鼠模型,证实NAFLD小鼠早期即存在肠源性内毒素血症。2 NAFLD小鼠肠黏膜上皮紧密连接Occludin蛋白表达减少,机械屏障受损,小肠绒毛变短、稀疏,肠道菌群失调,肠道通透性增加,可能是肠源性内毒素血症加重及促进细菌移位发生和发展的重要原因。3 Res可能通过调节肠道菌群、增加Occludin蛋白表达,抑制TNF-α等炎症反应,改善肠黏膜屏障功能,通过肠肝轴在NAFLD中发挥治疗作用。