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研究背景高胆固醇可抑制肌腱干细胞（TDSCs）腱性分化,然而胆固醇对TDSCs生物学性能的影响并没有阐明。研究表明,细胞凋亡和自噬可能参与调控肌腱变性过程。本研究旨在探讨自噬和凋亡是否参与高胆固醇诱导的肌腱病变,并揭示其机制及信号通路。方法:1.高胆固醇抑制TDSCs增殖,诱导其凋亡或自噬CCK8试剂盒检测不同浓度胆固醇刺激TDSCs1、3、5天后的OD值,根据结果选择胆固醇最佳浓度。Ki67免疫荧光检测增殖率,流式检测细胞周期变化情况。划痕实验检测胆固醇对TDSCs迁移率的影响。胆固醇刺激TDSCs后,检测凋亡细胞数目。检测cle-caspase3、Bax、Bcl-x1、PARP、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62等蛋白。应用mRFP-GFP-LC3腺病毒载体转染TDSCs,观察自噬体和自噬溶酶体。2.抑制TDSCs的自噬可促进凋亡,而抑制其凋亡可抑制自噬3-MA 处理 TDSCs,检测 cleaved-caspase3、Bax、Bcl-xl、PARP 等蛋白。TUNEL实验计数凋亡细胞,CCK8试剂盒检测细胞活性。Z-VAD-FMK处理TDSCs,检测 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62 等蛋白。3.高胆固醇诱导TDSCs的凋亡和自噬源于ROS水平上调DCFH-DA探针检测不同浓度、不同时间胆固醇刺激后ROS水平变化。NAC处理TDSCs,观察自噬体和自噬溶酶体,或检测NAC处理后的凋亡细胞比例、cleaved-caspase3、Bax、Bcl-xl、PARP、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62 等蛋白。4.高胆固醇使TDSCs产生活性氧,而活性氧又激活TDSCs中的AKT/FOXO1信号通路导致其发生凋亡和自噬检测胆固醇刺激后AKT、FOXO1、p-AKT、p-FOXO1等蛋白。FOXO1抑制剂 AS1842856 干预胆固醇刺激后的 TDSCs,检测 cleaved-caspase3、Bax、Bcl-x1、PARP、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62 等蛋白。检测NAC 处理后 TDSCs 中 AKT/FOXO1信号通路的变化。5.体内验证高胆固醇可诱导肌腱细胞凋亡和自噬采用10月龄ApoE基因敲除的小鼠作为高胆固醇组,而10月龄C57BL/6鼠做为对照组,取两组小鼠跟腱行HE染色观察形态及结构,Bonar评分系统量化组织学评分。免疫组织化学染色检测cleaved-caspase 3、Bax、Bcl-xl、PARP、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62 及 FOXO1 的表达。结果:1.高胆固醇抑制TDSCs增殖,并可诱导其发生凋亡和自噬10mg/dL以及100mg/dL胆固醇刺激对TDSCs的抑制作用最显著。选用10mg/dL作为研究浓度。在此浓度刺激下,Ki67阳性细胞比例明显下降,TDSCs增殖能力下降,刺激后细胞周期被阻滞在G0/G1期,G2/M期、S期细胞数目减少、凋亡TDSCs增加。胆固醇刺激12小时、24小时后cleaved caspase-3、BAX、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ 表达上调,PARP、Bcl-x1、p62 表达下调。并且 TDSCs中的自噬体和自噬溶酶体增多,表明胆固醇可诱导其发生凋亡和自噬。2.抑制TDSCs的自噬可促进凋亡,而抑制其凋亡可抑制自噬3-MA可减少胆固醇刺激后TDSCs中的自噬体和自噬溶酶体数量。3-MA下调 LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ、Bcl-xl 和 PARP 蛋白、上调 P62、cleaved-caspase3 和 BAX。3-MA增加TUNEL 阳性细胞比例,降低TDSCs的增殖能力。Z-VAD-FMK下调LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ上调p62。表明抑制自噬可促进凋亡,而抑制凋亡后自噬被抑制。3.高胆固醇诱导下激活的活性氧可诱发TDSCs凋亡与自噬高胆固醇上调TDSC活性氧水平的效应呈剂量和时间依赖性,ROS水平随胆固醇的时间增加、浓度增大逐渐升高。NAC处理后TDSCs的ROS水平明显下降,显著减少自噬体和自噬溶酶体数量。NAC减少凋亡细胞数,但与对照组相比差异不显著。此外,NAC下调cleaved-caspase-3、BAX、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ,上调Bcl-x1、PARP、p62。以上结果表明,活化的ROS水平是胆固醇所诱发的凋亡与自噬的使动因素。4.高胆固醇激活TDSCs产生活性氧,而活性氧可激活TDSCs中的AKT/FOXO1信号通路导致其发生凋亡和自噬胆固醇下调p-AKT、呈时间依赖性上调FOXO1、下调p-FOXO1。AS1842856显著抑制TDSCs的凋亡和自噬。NAC上调p-FOXO1和p-AKT,下调FOXO1。以上结果提示活性氧ROS可能是AKT/FOXO1信号通路的上游,可介导胆固醇引发的TDSCs凋亡和自噬。5.体内实验验证高胆固醇可诱导小鼠跟腱发生凋亡和自噬高脂饮食组小鼠跟腱HE染色显示其组织学特征明显劣于正常组,组织学Bonar评分显著升高。高脂组小鼠跟腱高表达cleaved-caspase 3、Bax、LC3-Ⅱ、FOXO1以及低表达的p62,表明高胆固醇可在体内引发凋亡和自噬。结论高胆固醇可上调TDSCs中的AKT/FOXO1通路,从而引起自噬和凋亡,这可能是因胆固醇的升高引起肌腱病的一种发病机制。应用他汀类药物或凋亡、自噬、FOXO1抑制剂等可能有助于治疗高胆固醇肌腱病,有助于提高患者预后及生活质量。