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背景卫气营血辩证是常见的中医辨证方法之一,但其分子生物学机制始终不明确。全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)是指感染或非感染因素作用于机体而引起的一种难以控制的全身性瀑布式炎症反应综合征,二者具有相似的演变过程,应该具有相同或相似的物质基础,并随卫气营血传变而异。本文从卫气营血辩证肺损伤时肺表面活性物质的动态变化,探讨卫气营血辩证的物质基础及与卫气营血辨证的关系。目的：构建卫气营血辩证肺损伤动物模型,筛选卫气营血辩证肺损伤模型的合适指标及指标群,并进一步研究卫气营血辩证肺损伤时肺表面活性物质的动态变化,旨在于揭示卫气营血辨证肺损伤的物质基础和卫气营血辩证肺损伤的分子机制。方法：1.造模及分组新西兰兔,雌雄各半,随机分为正常对照组和模型组(2h代表卫分组,6h代表气分组,12h代表营分组、24h代表血分组,各一组)。在无菌操作下,模型组各组于耳缘静脉推注LPS (Lipopolysaccharide,内毒素),1mg/kg,推注速度为10ml/h。正常对照组不做任何处理,直接取血,行肺泡灌洗,取肺组织标本待测。2.检测指标及方法①动物外观形态活动观察建模后连续动态观察兔饮食、二便、耳朵、结膜、呼吸、心跳、神志、体温、四肢、舌质等变化。②血浆及血清指标检测推注LPS后分别于2、6、12、24h用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉,腹主动脉取血进行心、肝、肾功能血生化测定,即：乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素(Urea).肌酐(Cr);血涂片显微镜下人工进行外周血白细胞分类计数；采用ELISA法和考马斯亮蓝法分别测定血清TNF-α和血清蛋白含量。③肺通透性指数测定采用N.S(生理盐水)对左肺泡进行灌洗,采用ELISA法和考马斯亮蓝法分别测定BALF(支气管肺泡灌洗液)上清中TNF-α(肿瘤坏死因子)和蛋白含量,计算肺通透性指数(LPI,LPI=BALF中蛋白浓度÷血清蛋白浓度)。④肺组织病理学观察肉眼观察右肺形态,并定位取同等大小部分右肺于4%多聚甲醛固定24h,经脱水、石蜡包埋,5μm厚切片,HE常规染色,光镜下观察肺损伤程度。⑤肺组织中SP-A (surfactant protein A,肺表面活性蛋白A)、SP-B (surfactant protein B,肺表面活性蛋白B)、SP-C (surfactant protein C,肺表面活性蛋白C)mRNA表达采用RT-PCR进行检测,操作方法按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂说明书进行。⑥TPL(total phospholipids,总磷脂)用Bartlett法进行测定,磷脂(以卵磷脂计mg/ml=(测定管光密度/标准管光密度)×2.5⑦DSPC(饱和卵磷脂)用Mason法进行测定。PS活性以饱和卵磷脂÷总蛋白(SatPC÷TP)来表示。⑧BALF中各磷脂组分含量标准品包括：磷脂酰胆碱(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和神经鞘磷脂(SPH),方法为HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发光散射检测器法)。3.统计学处理各组数据均以(x±sd)表示,组间差异性比较采用SPSS12.0统计软件进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1动物外观形态活动变化卫分组兔出现寒战,耸毛,蜷缩,发抖,耳血管收缩等恶寒表现,不饮不食,发热,耳结膜未见充血或轻度充血,神志清楚。气分组兔耸毛蜷缩发抖逐渐消失,但发热更加明显,呼吸心跳明显加快,较烦躁,饮水,吃食,耳廓血管充血扩张,眼结膜轻度充血,神志清醒,舌质较红。营分组兔眼结膜明显充血,神情萎顿,嗜睡,反应减慢,呼吸困难,喘促懒动,心跳较慢,耳血管收缩,尿少便溏,唇舌略微发紫。血分组兔眼结膜不再充血,变淡,耳朵苍白,摸之发凉甚至冰凉,神昏嗜睡,瘫卧或者呈半瘫卧状,大便稀溏,小便无,唇舌发绀,心律不齐,呼吸轻微,尖叫,抽搐,甚至死亡。相同观察时间,正常对照组动物反应灵敏,饮食如常,无上述异常表现。提示模型组动物存在血液流变学和微循环障碍,且随着时间的延长这种障碍表现越来越明显。2肺组织病理变化肉眼观察：卫分组肉眼见双肺轻度充血水肿,但未见有明显出血点。气分组肉眼见双肺充血较卫分组严重,双肺呈弥漫性充血水肿,体积明显增大,个别双肺见少数出血点,大多数充血但未见出血斑点。营分组肉眼见双肺体积增大显著,水肿表面有局灶性点片状出血,两肺下叶边缘尤其明显。血分组肉眼见胸腺出血点密集,双肺见多处较大片状或条索状淤血或者出血灶,几乎布满整个肺叶,肺切面有较多暗红色血性泡沫状液体形成。正常对照组双肺外观呈粉红色,无水肿,切面无渗液。提示模型组动物肺部损伤随着时间的延长加重。光镜下观察：卫分组肺泡间隔轻度增宽,毛细血管壁轻度充血。气分组肺泡间隔中度增厚,毛细血管明显充血,有少量中性粒细胞渗出。营分组肺泡结构严重破坏,肺毛细血管淤血,肺泡间隔重度增厚,肺泡及肺间质充满大量中性粒细胞和红细胞,血分组除具有营分组病理特征外,还有纤维蛋白渗出、气道粘膜上皮细胞脱落和透明膜的形成。正常对照组肺泡间隔及血管壁无水肿,无增厚,肺泡腔内无明显渗出,光镜下肺组织结构基本正常。说明随着时间的延长,模型组动物肺部炎性浸润逐渐加重,肺泡结构遭到破坏的程度逐渐加深,结果与肉眼观察相一致。病理评分结果：与正常组比较,模型各亚组病理损伤明显加重且具有显著性差异(P<0.05),各亚组之间病理评分也具有显著性差异(P<0.05),提示随时间的延长肺部病理改变明显。3体温变化与正常组相比,卫分组、气分组、营分组、血分组体温均极显著升高(P<0.01),随时间呈进行性升高趋势,卫分组、气分组、营分组、血分组各组之间体温无显著性差异。提示随着注射LPS时间的延长动物体温逐渐升高。4CK、LDH变化与正常组相比,卫分组、气分组、营分组、血分组CK水平显著升高(P<0.05)。LDH水平在卫分、气分、营分时呈持续性升高趋势,营分组和气分组相比LDH水平显著升高(P<0.05)。二者均在血分时回降,但仍高于正常组。表明模型动物心肌细胞可能遭到损伤或坏死。5ALT、AST、AST/ALT变化ALT主要存在细胞浆中,AST主要存在于细胞浆的线粒体中。ALT升高反映了肝细胞膜受到损伤,AST升高提示肝细胞损伤可能到了细胞器的水平。本研究结果显示,与正常组相比,ALT和AST水平在卫分、气分、营分、血分均呈进行性升高趋势。与正常组相比,卫分组、气分组、营分组、血分组ALT水平显著升高(P<0.05),营分组和血分组AST水平显著升高(P<0.05)。气分组和卫分组相比AST水平显著升高(P<0.05)。二者比值在营分、血分时显著升高(P<0.05),营分组和气分组相比显著升高(P<0.05),在血分时亦回降,但仍高于正常组。结果说明肝功能出现异常。6Urea、Cr变化与正常组相比,卫分组、气分组、营分组、血分组Urea水平显著升高(P<0.05)。气分组和卫分组、营分组和气分组、血分组和营分组两两比较Urea水平均具有显著性差异(P<0.05)。与正常组相比,血分组Cr水平显著升高(P<0.05)。与Urea一样,卫分、气分、营分时呈升高趋势,血分时略有回降,但仍高于正常组。结果提示注射LPS后动物肾功能异常。7外周血白细胞分类计数变化与正常组相比,卫分组、气分组、营分组、血分组中性粒细胞水平显著升高(P<0.05)。卫分组与正常组相比淋巴细胞水平显著升高(P<0.05),气分组与卫分组、营分组中性粒细胞水平和淋巴细胞水平相比均具有显著性差异(P<0.05)。营分组及血分组镜下见中性粒细胞增多增粗,血小板单个散在易见。以上结果表明有大量炎症物质及细胞因子释放入血。8血清及BALF液中TNF-α变化与正常组相比,气分组BALF液中TNF-α显著升高(P<0.05),营分组与气分组相比显著降低(P<0.05)。血分组与营分组相比血清中TNF-α显著降低(P<0.05),其他组之间二者均无显著性差异,说明模型组血清TNF-α无明显变化。BALF液中TNF-α在气分阶段上升到营分血分阶段下降,可能是肺损伤时肺部炎症由轻转重再由重转轻的过程,这可能是肺损伤有自愈转归要求的一种内在反映。9肺通透性指数变化与正常组相比,卫分组、气分组、营分组、血分组LPI呈持续性升高趋势,到血分阶段差异具有显著性(P<0.05)。LPI升高表明肺毛细血管通透性增高,可能是引起肺水肿/损伤的主要原因。10总磷脂(TPL)、DSPC、PS活性变化与正常组相比,TPL、DSPC、PS活性水平在卫分、气分、营分时呈持续性降低趋势,下降到一定程度之后,又会随着时间的延长在血分时略上升,血分组与营分组相比具有显著性差异(P<0.05)。回升现象可能与肺Ⅱ型上皮细胞内磷脂因肺泡内的磷脂含量减少而大量代偿分泌有关。11BALF及血清中蛋白含量变化与正常组BALF蛋白含量相比,卫分、气分、营分、血分各组及各亚组之间均无显著性差异(P>0.05),说明卫气营血辩证肺损伤时BALF中蛋白无明显变化。与正常组相比,血分组血清蛋白含量具有显著性差异(P<0.05)。营分组与气分组及血分组相比均具有显著性差异(P<0.05)。结果表明卫气营血辩证肺损伤血清蛋白含量到血分阶段才发生明显变化。12肺组织SP-A、SP-B、SP-C mRNA的表达变化卫分、气分、营分、血分各阶段,模型组肺组织SP-A mRNA表达呈下降趋势,且卫分、气分、营分、血分各组与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05),卫分、气分、营分、血分各亚组之间进行组间比较亦均有显著性差异(P<0.05)。SP-B mRNA表达具有相同的实验结果。SP-C mRNA表达与SP-A和SP-B mRNA表达趋势一致。提示SP-A、SP-B、SP-CmRNA表达水平的减弱导致肺局部免疫功能降低可能是产生卫气营血辩证肺损伤的主要机制之一。13BALF中各磷脂组分含量变化与正常组相比,PC、PE水平在卫分时略有升高,气分、营分、血分时呈持续性降低趋势,但各亚组与正常组比较及各亚组间比较均无显著性差异。溶血卵磷脂(LPC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和神经鞘磷脂(SPH)在正常组和各模型组样本中均未检测到。PC相对含量减少可能是引起PS活性抑制及肺损伤的重要原因。结论：1.兔耳缘静脉输注内毒素所建立的温病卫气营血辩证肺损伤模型,其生物学参数数据化表达库中,卫分、气分、营分、血分各组之间Urea均具有显著性差异,可以作为区分卫分证、气分证、营分证和血分证的指标；体温、ALT与肺损伤评分呈显著正相关,LPI与肺损伤评分呈极显著正相关,体温、ALT、LPI可以作为区分卫分证、气分证、营分证和血分证的参考指标；它们均是卫气营血辩证肺损伤演变的客观物质基础。2.卫气营血辩证肺损伤时肺泡灌洗液中TPL、DSPC、PS活性与正常组相比表达均降低,肺表面活性物质的产生减少,PS质和量的异常是肺损伤发生发展的重要机制；3.卫气营血辩证肺损伤模型兔肺表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-C mRNA表达呈时间依赖性降低,是卫气营血辩证肺损伤的重要物质基础之一。4.磷脂组分的变化可作为肺泡损伤早期的参考指标,连续观测有助于判断预后,PC相对含量减少可能是引起PS活性抑制及肺损伤的重要原因。综合上述结果发现,AST/ALT、Urea、LDH、CK、Cr、血清中TNF-α各指标均在卫分、气分、营分阶段上升,血分阶段有所下降。与此相反,TPL、DSPC、PS活性指标变化趋势卫分、气分、营分阶段下降,血分阶段有所上升。这可能是肺损伤有自愈转归要求的一种内在反映；体温、LDH、AST、ALT、AST/ALT、Urea、Cr、中性粒细胞、淋巴细胞、BALF中TNF-α、 LPI、血清蛋白、SP-A mRNA、SP-B mRNA、SP-C mRNA、DSPC各指标在卫气营血辩证某一个或几个阶段与正常组相比均有显著性差异。而CK、血清TNF-α、 BALF中蛋白、PC、PE在任意阶段与正常组相比均无显著性差异。由此说明,CK、血清TNF-α、 BALF中蛋白、PC、PE相对其他指标而言,在肺损伤发生过程中受肺损伤的影响较小,不适合作为卫气营血辩证肺损伤的参考指标。