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异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase, IDH)是三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环中的关键酶,在生物体的能量代谢和生物合成代谢中起重要作用。IDH广泛分布于真核生物、细菌和古生菌中。根据辅酶特异性,IDH可分为 NAD+-依赖型(EC1.1.1.41)和 NADP+-依赖型(EC1.1.1.42)两种。从结构上看,IDH主要包括单体和二聚体两种类型。目前认为单体 IDH是由同源二聚体 IDH通过结构域的融合(fusion)、基因倍增(gene duplication)、插入(insertion)和缺失(deletion)等机制演化而来。 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是导致水体富营养化和产生藻毒素的藻类之一,其基础代谢相关酶类的研究较少。本实验对来至 M. aeruginosa PCC7806的IDH(MaIDH)基因进行了克隆表达,SDS-PAGE及分子筛鉴定发现,MaIDH的活性形式为同源二聚体,且单亚基相对分子量为52.6 kDa。酶动力学鉴定发现其辅酶特异性为完全 NADP+-依赖型,Mg2+和 Mn2+为其激活剂。MaIDH的最适温度分别为45°C(Mn2+)和50°C(Mg2+);最适 pH为7.5;热失活研究发现,在45°C孵育20 min后将导致50％的活力丧失。以 Mg2+为激活剂时,MaIDH对 NADP+和底物 DL-异柠檬酸(DL-isocitrate,简称 ISO)的Km分别为32.24μM和32.56μM;以 Mn2+为激活剂时对 NADP+和 ISO的Km分别为79.71μM和124.3μM。Mg2+存在时的MaIDH对辅酶 NADP+和底物 ISO的亲和力(1/Km)分别是 Mn2+存在时的2.5倍和4倍。 为了研究单体 IDH的分子进化机制,本实验还选择了与 MaIDH属于同一亚家族且晶体结构已解出来的E. coli IDH(EcIDH)为研究对象,对其进行结构改造。通过改造,我们得到了相对分子量为62 kDa的单体 E. coli IDH(Monomeric EcIDH,简称 MonoEcIDH)。酶动力学分析发现,以 Mg2+为激活剂时,MonoEcIDH对 NADP+和 ISO的Km分别为34.79μM和33.62μM,表明 MonoEcIDH对辅酶和底物的亲和性很高,但是其催化效率 kcat/Km(μM-1s-1)不高,大约是其它单体 IDH的1/100左右。进一步提高酶催化效率的工作正在进行中。 本实验通过对铜绿微囊藻基础代谢中的关键酶 IDH的研究,将可能为控制蓝藻污染提供有用信息。同时,将 E. coli二聚体 NADP-IDH改造为单体 NADP-IDH的研究,为单体 IDH由二聚体 IDH演化而来的进化关系提供了实验证据。