白粉菌诱导下小麦早期反应基因的筛选及功能分析

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:frankcody
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专性寄生真菌小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp. tritici, Bgt)引起的小麦白粉病是一种危害严重的世界性病害。在小麦(Triticum aestivum L.)中,针对白粉菌的小种专化抗性由Pm基因控制。本研究的目的是:1)在细胞学水平上揭示Pm基因介导的抗性反应特性;2)筛选白粉菌诱导下小麦早期反应基因并对其功能进行验证,以期初步解释Pm基因的作用机制。研究采用三个感性(百农3217,北京837和京双16)和五个抗性(Mardler[Pm2+Pm6],Ulka/8*Cc[Pm2],Mardler/7*百农3217[Pm2],Pm16和Pm16/7*北京837[Pm16])小麦品系,比较分析亲和及非亲和互作中接种后10到48小时(Hours after inoculation,hai)的过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)反应特性;并应用cDNA-AFLP技术筛选抗白粉病近等基因系Mardler/7*Bainong3217及其感病亲本Bainong3217经白粉菌诱导后早期反应基因;分析小麦脂质转运蛋白基因在不同倍性材料中的存在情况及不同胁迫条件对小麦脂质转运蛋白基因表达的影响;对候选早期表达基因及小麦脂质转运蛋白基因采用瞬时表达体系进行功能分析。研究结果如下:1、通过比较分析小麦与白粉菌亲和及非亲利互作过程中小麦叶片针对白粉菌BgtE09初生芽管(Primary germ tube,PGT)、附着胞芽管(Appressorial germ tube,AGT)、以及乳突和过敏反应(Hypersensitive response,HR)中H2O2的聚集情况,发现:1)在感性和抗性小麦品系的有效乳突以及邻近细胞质囊泡中均检测到了强H2O2聚集,表明作为对白粉菌的一般性防御,H2O2在有效乳突的形成中发挥着重要作用;2)在所有五个抗病品系中均检测到了高于感病品系的有效乳突频率;3)在抗性品系中,Mardler和Ulka/8*Cc高频率HR的出现早于Pm16和Pm16/7*北京837,但所有HR反应均表现为整个受攻击的表皮细胞充满H2O2;4) Pm2基因在近等基因系Mardler/7*Bainong3217中表现穿透抗性而非HR表明该基因在上述遗传背景中或许介导了一个非HR依赖的防御路径;5)在小麦与白粉菌非亲和互作中,HR作为限制病原菌侵染的第二道防线,当乳突反应不能有效阻止病原菌侵染时发挥作用。2、本研究利用cDNA-AFLP技术对白粉菌诱导下小麦叶片早期反应基因进行分析。实验共筛选AFLP引物组合(PstⅠ/MseⅠ)553对,获得差异片段283条。在测序的61条差异片段中,有26条与功能已知或未知的植物基因具有一定的序列相似性。选择其中6条和另外一条与细菌基因具有一定相似性的片段,应用基因特异引物进行半定量RT-PCR。结果有3条序列的表达模式得到了验证。我们分离了其中2条序列的完整编码区,它们分别是:小麦钙依赖性蛋白激酶2(TaCDPK2,acc. No.AY704444)和小麦氧化还原氧还蛋白1(TaPrxl,acc. No. AY789643)。TaCDPK2编码区1677bp(558个氨基酸),包含丝氨酸/苏氨酸激酶域(氨基酸:96-360)和钙调素类结构域(氨基酸:392-535,包括4个EF手性区)。接菌后3小时和6小时,TaCDPK2在抗性及感性材料中均呈现上调表达,表明TaCDPK2是一个一般性真菌防御基因,而不是抗性材料中针对白粉菌诱导特异表达的基因。TaCDPK2还表现为受盐和干旱胁迫诱导,表明该基因在小麦抗病、抗逆反应中普遍存在。TaCDPK2的表达不受低温胁迫诱导,且表现组织特异性。TaPrxl编码区654bp(217个氨基酸),包含一个AhpC-TSA13保守域(氨基酸:73-196)。接菌后,TaPrxl在抗性材料中呈现上凋表达的时间点早于感病材料(在取样时间范围内,约3小时)。TaPrxl瞬时过量表达的结果表明:与对照相比,过量表达TaPrxl使感病材料百农3217叶片上白粉菌的穿透率(Penetration efficient,PE)降低了25%。表明TaPrxl可能作为小麦白粉病抗性反应的一个早期调节子。TaPrxl的表达受低温/干旱/盐胁迫诱导,而且只在植物绿色组织中表达。另一个表达模式得到验证的差异片段为TDF A27,我们只获得了其相应的cDNA片段(608bp)。该608bp片段(flame=+3)假定氨基酸序列与水稻植物激素应答因子2(Auxin response factor 2,ARF2)的相似性为86%,并覆盖B3和auxin response两个保守域。经白粉菌诱导后,只在感病材料的1,3,6时间点检测到该片段所代表基因的转录本,而在感病材料其它处理时间点以及抗病材料所有取样时间点均未检测到其转录本,推测该基因可能与小麦感病性有关,这是首次关于植物激素路径与植物抗病防御反应路径有所交叉的报道。3、小麦LTP1基因参与了白粉病抗性反应:小麦LTP基因表达可被盐、干旱胁迫诱导并具有组织特异性;LTP1和LTP2在进化中比较保守;来自A基因组的LTP4是一个新发现的小麦LTP基因。
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