Hela细胞与人子宫内膜基质细胞中miRNA Let-7及其靶基因的关系研究

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:yanguoke
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MicroRNAs(miRNAs)是一类在进化上高度保守的,内源性非编码小分子RNA,它可以通过与靶基因mRNA的3UTR互补配对结合的方式特异性的降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻译从而调控基因的表达。MicroRNA let-7最早在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现,与线虫的生长,时序性发育和从幼虫到成虫的形态转换有关。目前,在人的基因组中,有13种前体序列,能够生成10种成熟的let-7 miRNAs。我们先前的研究表明let-7在流产蜕膜中的表达显著低于在早孕蜕膜中的表达。假设let-7可以通过调控靶基因的表达参与早期妊娠维持。  目的;⑴预测let-7f-5p,let-7g-5p和let-7i-5p的靶基因;⑵在体外水平验证let-7f-5p,let-7g-5p和let-7i-5p与各自候选靶基因的靶向关系。  方法;利用在线分析软件(Target Scan,PicTar和MiRanda等)预测let-7f-5p,let-7g-5p和let-7i-5p的靶基因。在三种不同的人的细胞系HEK293T, Hela和H-ESCs中过表达或敲减let-7f-5p,let-7g-5p,let-7i-5p后在mRNA和蛋白水平检测各自候选靶基因的表达。  结果:①IGF2BP-1 mRNA3UTR有let-7f-5p的结合位点;在HEK293T, Hela和H-ESCs这三种不同的细胞中转染let-7f-5p模拟物后,qRT-PCR结果表明,IGF2BP-1 mRNA的表达均显著减少(P<0.05);转染let-7f-5p抑制剂后,IGF2BP-1的表达显著上调(P<0.05)。此外,在Hela细胞中过表达let-7f-5p后,同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)的结果显示IGF2BP-1蛋白的表达显著下调(P<0.05);抑制let-7f-5p后,iTRAQ的结果显示IGF2BP-1蛋白的表达显著上调(P<0.05)。②IGF-2R mRNA3UTR有let-7g-5p的结合位点;在Hela细胞中转染let-7g-5p模拟物后,qRT-PCR和ELISA的结果显示,IGF-2RmRNA和蛋白的表达显著上调(P<0.05)。转染let-7g-5p抑制剂后,qRT-PCR和ELISA的结果显示,IGF-2R mRNA和蛋白的表达显著下调(P<0.05)。③LIF和IL-6 mRNA3UTR都有let-7i-5p的结合位点;在HEK293T, Hela和H-ESCs细胞中转染let-7i-5p模拟物后,qRT-PCR的结果表明,三种细胞中LIF和IL-6 mRNA的表达均显著升高(P<0.05)。转染let-7i-5p抑制剂后,LIF和IL-6 mRNA的表达显著降低(P<0.05)。  结论:IGF2BP-1可能是let-7f-5p的一个靶基因,let-7f-5p可以靶向负调控IGF2BP-1的表达。在mRNA水平,let-7i-5p与LIF和IL-6的表达呈正相关。在Hela细胞中,let-7g-5p的表达与IGF-2R的表达正相关,且mRNA水平,let-7g-5p对IGF-2R的调控与细胞类型有关。
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