论文部分内容阅读
新陈代谢是生命体生命活动的基础,是物质代谢和能量代谢的结合。微孢子虫是细胞内寄生的真核生物,宿主域广泛,寄生环境的复杂多样使得不同种属的微孢子虫的代谢情况存在很大的差异。对微孢子虫的基因组分析发现其基因组中编码蛋白的序列在长度和数量上都有着很大程度的缩减,尤其是与代谢相关的基因,因此微孢子虫的代谢研究一直是学者关注的热点。对家蚕微孢子虫的基因组分析发现家蚕微孢子虫拥有完整的糖酵解途径,能够通过该途径获取生命活动所需的部分能量。烯醇化酶(Enolase,ENO)是糖酵解过程中的限速酶,对烯醇化酶的研究能够为我们更好地了解微孢子虫的能量代谢提供一定的基础。且近年来也有烯醇化酶新的功能的发现报道,因此烯醇化酶在家蚕微孢子虫的生命活动中是否参与到其他的过程当中也是我们关注的问题。本研究依据微孢子虫数据库中家蚕微孢子虫烯醇化酶的编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫DNA为模板PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因NbENO。生物信息学分析结果显示该基因ORF全长1239 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 kD,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成;含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点;无信号肽和跨膜结构域存在,不具备典型的分泌蛋白和跨膜蛋白的特征。通过与数据库中其他12种微孢子虫的烯醇化酶的系统进化树分析结果显示NbENO与蜜蜂微孢子虫烯醇化酶基因序列(NcENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的编码基因一致性为62.10%。将NbENO基因插入原核表达载体pET-28a,构建原核表达载体pET-28a-NbENO,在目的蛋白N端引入6×His标签;重组质粒转化Rosatta(DE3)感受态细胞,构建重组蛋白NbENO的原核表达系统,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测和Western Blot的检测结果显示诱导表达的重组蛋白约50kD大小,结果与预测相符,证明成功地获得了原核表达的重组蛋白NbENO。通过镍亲和柱纯化获得重组蛋白NbENO,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,通过Protein A亲和纯化抗体anti-NbENO-Ab。经ELISA检测抗体效价为1:512,000,Western Blot验证显示anti-NbENO-Ab与NbENO有较强的特异性结合,能够满足之后实验的要求。通过对家蚕微孢子虫侵染家蚕后NbENO在不同时间点表达的半定量结果分析可知NbENO在家蚕微孢子虫侵染的整个过程均有表达。对家蚕微孢子虫感染的家蚕P50中肠组织和家蚕BmN细胞不同时间点NbENO的表达情况的分析显示:NbENO在家蚕微孢子虫侵染宿主细胞的早期表达量显著高于其他时期,在侵染3天后表达水平趋于稳定。通过间接免疫荧光技术对NbENO在家蚕微孢子虫的成熟孢子中进行亚细胞定位。定位结果显示NbENO分布于家蚕微孢子虫成熟孢子细胞壁上,在微孢子虫发芽后的孢子壳中也有分布,而在微孢子虫的孢原质中未见明显的荧光信号。本研究通过生物信息学技术对NbENO进行分析和原核表达系统表达重组蛋白NbENO,为NbENO的生物学功能的研究奠定了基础。通过NbENO在家蚕微孢子虫侵染宿主后不同时间点的表达情况结合NbENO的亚细胞定位结果,推测糖酵解途径是家蚕微孢子虫侵染宿主细胞早期的主要能量来源,并且NbENO在家蚕微孢子虫的生活史中或许存在其他的功能。