杂色云芝启动漆酶合成的氮代谢阻遏及其机制研究

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xing_h0576
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杂色云芝(Trametes versicolor,简称Tv)因能高产漆酶(Laccase,Lac)而成为继黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium,简称P.chrysosporium)之后的又一白腐菌(White Rot-fungi,WRF)典型种。随着研究的深入,对杂色云芝合成的漆酶是受氮阻遏控制的次生代谢产物,培养基氮耗尽是启动产酶的前提这一认识已取得某些突破性成果和显著成就。即便如此,至今对漆酶氮代谢及调控机制的了解仍然十分有限。介于目前对杂色云芝漆酶氮代谢深度研究的严重滞后,以及氮阻遏形成与调控机理研究空白的现状,本论文利用杂色云芝出发菌株Tv5336及紫外诱变选育得到的1株诱变菌株TvR4,探究其生长与产酶特性,并通过氮素调控研究、次生代谢诱导机制研究、氮代谢阻遏调控机制研究,以期揭示杂色云芝合成漆酶的调控机制并增进对木质素降解机制的了解,结果如下:(1)通过菌株生长及产漆酶特性研究可知:在限氮条件下,Tv5336的生长存在明显的3个阶段:对数期(1-8 d)、稳定期(9-13 d)及衰亡期(14-15 d);在富氮条件下,对数期变长,稳定期消失直接进入衰亡期。TvR4在限氮条件下,只有对数期和稳定期,而在富氮条件下,菌体生长明显变快。在限氮条件下,Tv5336酶活表现不强,在生长稳定期的产酶量达到最大,在衰亡期后期酶活趋于稳定;在富氮条件下,Tv5336产酶活性有所提高,稳定期较长,产酶高峰均有推后。在限氮条件下,TvR4的2个峰值分别为第6 d的16 740 U/L和第12 d的21 230 U/L;在富氮条件下,TvR4初生代谢期的酶活峰值同样低于次生代谢时期的酶活,2个峰值分别为11 230 U/L和23 170 U/L。综上,富氮有利于2菌株生长,不同营养条件对不同菌株产漆酶的影响不同。(2)通过菌株的氮素调控机制研究可知:不同氮源种类条件下,不同菌株的生长产漆酶状况各不相同。Tv5336以尿素(Urea)为最佳氮源,TvR4则以酒石酸铵(Ammonium tartrate)为最佳氮源。从氮素形态对Tv5336产Lac的影响来看,其大小顺序为:酰胺态氮>硝态氮>铵态氮;对于TvR4,影响大小顺序则为铵态氮>酰胺态氮>硝态氮。在不同氮浓度条件下,TvR4生长受氮浓度影响的程度比Tv5336小,但其漆酶酶活明显高于Tv5336。另外,Tv5336开始产酶的临界氮浓度分别是限氮条件时1.111 mg/L和富氮条件时1.194 mg/L;达产酶高峰时临界氮浓度分别是限氮条件时0.316 mg/L和富氮条件时0.692 mg/L。TvR4开始产酶的临界氮浓度分别是限氮条件时1.341mg/L和富氮条件时1.529 mg/L;达第1个产酶高峰时临界氮浓度分别是限氮条件时0.799 mg/L和富氮条件时0.906 mg/L,达第2个产酶高峰时临界氮浓度分别是限氮条件时0.443 mg/L和富氮条件时0.413 mg/L。不同营养条件下,Tv5336、TvR4产酶峰值出现时的浓度/生物量比值差异显著。(3)通过对菌株生长产酶的诱导机制(主要是温度因素)研究可知:不管是在限氮还是富氮条件下,2种菌株的生长受温度的影响都比较明显,诱变菌株TvR4生长的最佳温度均比Tv5336高。Tv5336生长的最佳温度为28℃,TvR4生长的最佳温度为37℃。短时间的热激能刺激产酶,但最终又会回到与初始值一样的酶活活性。说明菌株次生代谢有可能由温度诱导。(4)通过对菌株生长产漆酶的氮代谢阻遏(Nitrogen metabolism Repression,NMR)及其调控机制的研究可知:①在单一氮源的情况下,Tv5336、TvR4只能利用其作为生物产酶所需的氮源;当培养基中既存在丰富型氮源(如酒石酸铵)又存在贫乏型氮源(如尿素)时,优先利用丰富型氮源,即Tv5336、TvR4对氮源利用受氮代谢阻遏的调控。②在Tv5336、TvR4氮代谢过程中均有谷氨酸(Glutamic acid,简称Glu)和谷氨酰胺(Glutamine,简称Gln)的产生。Gln和Glu的浓度的波动和酶活波动的方向基本相反,说明漆酶活性与Glu及Gln密切相关。③外加0.01%或0.05%的谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,简称GS)抑制剂时,Tv5336、TvR4生长产酶均受到抑制。Gln可以解除GS抑制剂对TvR4的抑制作用,但对Tv5336作用不明显,说明Tv5536和TvR4本身的基因表达存在差异。④阿托品是环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,简称cAMP)的抑制剂,它能抑制Tv5336、TvR4产酶。⑤α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid,简称α-KG)在一定程度上调控Tv5336、T vR4的生长产酶。⑥2菌株产生NO的机理不同,并且NO对Lac合成所起的作用并不因营养条件的改变而改变,说明NO的作用可能仅仅是作为第二信使。硝普钠(Sodium Nitroprus side,SNP)的加入均能使2种菌株在不同营养条件下的产酶量得到不同程度的提高,说明NO对其产Lac有促进作用。⑦Tv5336和TvR4均受到硝化胁迫时,产酶受抑制;但TvR4表现出比Tv5336更顽强的生命力。
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