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目的：为推动我国HbA1c测定的标准化，在国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法的基础上，我们应用液相色谱串联三重四极杆质谱仪建立了准确测定糖化血红蛋白的参考方法并尝试进行临床应用。 方法：依据IFCC推荐的糖化血红蛋白参考测量方法实验流程处理血液标本，使用WateroasisHLBC18反向柱进行质谱前处理（固相萃取），设定最适实验条件后，应用液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定样本中糖化血红蛋白含量，并使用满足计量学特性的国际有证标准物质IRMM/IFCC466(HbA1c)和IRMM/IFCC467(HbAO)为校准物质，绘制标准曲线，建立参考方法并进行方法学验证;在上述工作的基础上，分别应用两种常用的蛋白水解酶酶解血红蛋白，进行SDS-PAGE电泳，衡量血液样本中蛋白酶解的效率，再将消化后的血红蛋白肽段经清洁及除盐后，进行质谱分析，测定标本中糖化血红蛋白的含量;研制糖化血红蛋白候选标准物质，开展北京地区糖化血红蛋白正确度验证结果调查。 结果：在1个月内对三个浓度水平的血液标本重复测定4次，每批次重复测定3遍，批内CV为0.9144％～1.0628％;批间CV为0.9528％～2.0564％;总CV为1.6902％～2.0813％。经实验证实，该测定方法未发现明显系统误差。基质中已知的其它成分对测定结果的干扰在可接受范围内。测定卫生部临床检验中心(NCCL)研制的国家一级糖化血红蛋白标准物质(GBW09181，GBW09182，GBW09183)的糖化血红蛋白浓度，结果与认定值的偏差分别为+0.78％，+3.04％，+1.74％，三个水平HbA1c浓度的总CV分别为2.03％，0.76％，1.77％。严格操作条件下，用本法分别测定3份加入已知量糖化血红蛋白前、后的浓度，计算回收率分别为97.8％，98.0％，103.2％。由SDS-2D-PAGE胶电泳可见血红蛋白条带经酶解后明显变浅或消失，两种蛋白酶消化血液标本后经质谱仪检测，均可以获得比较一致的结果，差异无统计学意义。 结论：待测样本经质谱前处理后，应用液相色谱串联三重四极杆质谱仪准确测定糖化血红蛋白，经实验验证测定样本信号强度、精密度、准确度较高，实验耗时短，即保证了实验结果的准确性，又提高了质谱仪的利用率，建议将其作为测定糖化血红蛋白的参考测量方法。由SDS-2D-PAGE胶电泳可见血红蛋白条带经酶解后明显变浅或消失，证实两种蛋白酶均能很好的完成对血红蛋白的消化且Lys-C胰蛋白酶在较高糖化血红蛋白浓度时酶解蛋白的效率优于GLU-C胞内蛋白酶，通过应用LTQ-OrbitrapVelos质谱仪对样本中糖化血红蛋白进行定量分析，经实验证实，两种蛋白酶消化血液标本后经质谱仪检测，均可以获得比较一致的结果，差异无统计学意义，推荐可以使用文中所列方法将TrypsinGold作为质谱法检测糖化血红蛋白的特异性水解酶。