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钙调蛋白磷酸酶(Caldneurin,CN)是唯一活性依赖Ca2+/钙调素调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,其在神经系统、免疫系统以及心血管系统的生理病理过程中,参与一些重要基因的表达与调控,在生命活动中起着十分重要的功能。本实验室在前期工作中对CN在体外与蛋白之间的相互作用、在T细胞以及动物模型中的功能进行了初步研究,为了进一步研究CN在信号转导通路中的功能,我们通过酵母双杂交筛选的方法寻找CN新的生理底物。
本文选用SH—SY5Y细胞进行cDNA文库的构建,通过与CNA以及BA蛋白的双杂交筛选我们得到了CN的新的结合蛋白PSMA6。通过运用包括GST-Pull down,免疫共沉淀以及突变体构建等实验方法,我们验证了这种新颖蛋白的相互作用,同时还确定了PSMA6N端结构域上第63和64的丝氨酸是发生这种相互作用所必须的。随后,通过在SH-SY5Y细胞中过表达PSMA6的点突变体,我们发现在细胞内可以与CN发生相互作用的是同游离态的PSMA6发生相互作用而不是蛋白酶体中的PSMA6。为了讨论CN与蛋白酶体活性之间的关系,我们对二者的活性分别进行了测定,发现CN可以活化蛋白酶体的活性,并且FK506和CsA都可以对二者的活性进行抑制。再进一步的细胞免疫荧光实验中,我们也证实了这种活化作用是通过CN与细胞内PSMA6相互作用实现的。在对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的实验中我们发现,CN的活性对于拮抗凋亡是必不可少的。CN通过对蛋白酶体活性的调控,能够迅速降解细胞内包括IκBα,IκBβ,p100以及p105在内的IκB家族蛋白。通过对IκB蛋白降解的调控从而激活NFκB蛋白的活性,从而在由H2O2所引起的氧化应激过程中诱导Bcl-2,SOD-1,SOD-2以及CAT的表达来拮抗凋亡。此外,在动物实验中,我们发现在长时间进行CsA灌胃的小鼠脑中,抗氧化蛋白SOD-1和SOD-2显著性的降低,而IκBα和IκBβ的蛋白水平则有不同程度的升高,说明CN可以通过活化NFκB调控基因的表达。本文同样也对免疫细胞中CN对NFκB的调控进行了研究,发现CN同样可以通过活化蛋白酶体的活性进而激活NFκB信号通路,从而使RAW264.7以及小鼠树突状细胞中炎症因子mRNA表达水平的上升。基于以上的实验结果,我们认为在外界刺激发生时,CN可以通过激活蛋白酶的活性从而对NFκB的活性进行调节,并提出了一个新颖的CN调控NFκB活性的模式,这种新模式可能有助于了解在神经退行性疾病,特别是在阿尔茨海默氏病中,CN的功能。