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金属硫蛋白(metallothionein,MTs)是自然界中普遍存在的一类低分子量、高Cys含量、具有金属结合能力的蛋白质。植物MTs被认为在解除重金属离子的毒害、维持组织中金属离子的平衡、调节金属离子向特定组织的运输及ROS的清除等方面起作用,与植物的抗逆反应有关,可增强植物对逆境的耐受性。目前的研究表明MT蛋白参与了许多重要的生理生化过程,该类蛋白是植物防御体系中的一类重要蛋白,但是关于其在植物中的生理功能的研究还不是很深入,有些现象还无法解释。星星草(Puccinellia tenuiflora)中2型金属硫蛋白PutMT2的表达受NaCl、H202、CuCl2等非生物胁迫的诱导,并且可提高转基因酵母对高盐、金属离子ZnCl2、FeCl3等的胁迫的耐受性,表明PutMT2可能与星星草的逆境适应有关。而在细胞中各种蛋白发挥功能都离不开与其他蛋白质之间的相互作用。通过筛选获得金属硫蛋白的互作蛋白并进一步在功能上进行解析,有助于解释金属硫蛋白在提高植物抗性与生长发育中的作用。在本研究中,为更好的了解金属硫蛋白在植物细胞中的功能和作用机制,对PutMT2蛋白的金属结合功能进行了研究,并通过酵母双杂交系统筛选2型金属硫蛋白的相互作用蛋白并对它们在植物氧化胁迫响应中的作用进行了分析,主要得到了以下结果:1、PutMT2基因在根、茎、叶、花、鞘中都有表达,在鞘中表达最多,在叶中表达多于根中;PutMT2基因的表达受到NaCl、H202、CuCl2、ZnCl2胁迫逆境的诱导表达;PutMT2定位于细胞质中。PutMT2蛋白可结合Zn、Na并提高转基因酵母对ZnCl2及NaCl胁迫的抗性,PutMT2蛋白可结合Cu但使转基因酵母对CuCl2胁迫敏感。在这三种离子中PutMT2蛋白结合Cu的能力最强,结合Na的能力最弱。2、我们利用酵母双杂交系统筛选PutMT2的相互作用蛋白,得到了两个候选靶蛋白分别为线粒体外膜电压依赖性阴离子通道3(AtVDAC3)和硫氧还蛋白m2(AtTrx m2),并且在酵母水平上验证了拟南芥(Arabidopsis thaliana)2型金属硫蛋白AtMT2a和AtMT2b也都可以分别与AtVDAC3和AtTrx m2发生相互作用。利用酵母双杂交系统确认了 AtMT2a和AtMT2b都可分别与AtVDAC3相互作用,并且不能与其他VDAC互作,特异的与AtVDAC3互作,互作区域为AtVDAC3的N末端;通过Pull Down实验验证了 AtMT2a和AtMT2b分别与AtVDAC3在体外的直接互作;而双分子荧光互补实验(BiFc)确认了 AtMT2a和AtMT2b分别与AtVDAC3蛋白在体内互作,并且互作位置在线粒体。利用GFP荧光定位分析表明AtMT2a和AtMT2b均为胞质蛋白,AtVDAC3蛋白定位于线粒体。3、金属硫蛋白是富巯基蛋白,与细胞内的ROS解毒有关,作为线粒体外膜上的通道VDAC与细胞内的氧化还原状态息息相关。所以我们主要对AtMT2b和At VDAC3在拟南芥氧化胁迫逆境响应中的作用进行了研究,更好的了解这两个蛋白在植物中各自行使的功能,分析其中蛋白互作的机制与意义。首先通过荧光定量PCR分别对AtMT2b和AtVDAC3基因在拟南芥生长及胁迫逆境处理中的表达情况进行了研究。结果表明AtMT2b和AtVDAC3基因可在检测的所有的样品中都表达,并且都是在幼叶中的表达高于在成熟叶和衰老叶片中,但AtMT2b基因在幼叶中表达高于根中,而AtVDAC3基因在根中表达量高于叶中;并且两个基因的表达都受到了高盐、渗透、金属离子等氧化胁迫的诱导,表现出与氧化胁迫的应答关系。接下来分析测定了 AtMT2b和AtVDAC3的突变体及过表达转基因拟南芥植株在各氧化胁迫下的生长表型和ROS产量,并重点分析了 NaCl处理条件下AtMT2b和AtVDAC3对细胞中ROS含量及线粒体膜电位的影响。结果表明:AtMT2b突变后使拟南芥对NaCl、H202、CuCl2、ZnCl2、CdCl2等胁迫更加敏感并积累更多的ROS,在NaCl胁迫下线粒体膜电位低于WT;而AtMT2b过表达提高了拟南芥对各胁迫的抗性并降低了 ROS含量,在NaCl胁迫下细胞线粒体膜电位得到维持。At VDA C3的突变体advdac3#7对NaCl、H202、CuCl2、.ZnCl2、CdCl2等胁迫表现出较强的抗性和较低的ROS含量,在NaCl胁迫下线粒体膜电位高于WT,并使细胞内ROS水平降低,而AtVDAC3过表达拟南芥表现出相反的表型。这些结果说明AtMT2b和AtVDAC3均可在拟南芥逆境胁迫响应中起作用,且可影响盐胁迫条件下细胞内ROS的产量和线粒体膜电位的状态。但AtMT2b对拟南芥胁迫响应的影响与At VDAC3的表现是相反的。综上所述,拟南芥中2型金属硫蛋白AtMT2b可与线粒体外膜通道蛋白AtVDAC3相互作用,并且两者都可在植物逆境防御中发挥重要作用。但是AtMT2b与AtVDAC3之间的互作机制及互作后的作用还需要深入的研究。