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前言：
先天性脊柱裂在人群中的发病率为1‰-5‰,中国的发病率要明显的高于西方国家。根据目前的研究结果表明,先天性脊柱裂多为遗传病,受环境因素和遗传因素共同影响。随着产前诊断的发展,越来越多的脊柱裂可以在胎儿期被诊断出来,早期发现和治疗有利于脊柱裂治疗效果的提高。现有在胎儿阶段对脊柱裂的治疗只有胎儿外科,但是由于手术条件等诸多限制导致治疗效果不尽如人意。有许多孕妇由于缺少有效的治疗方法,被迫选择中止妊娠。为了使更多家庭免受这样的痛苦,我们寻求更好的治疗脊柱裂的方法。组织工程技术的日益发展为我们提供了新的思路,目前有许多疾病可以结合组织工程得到很好的治疗,例如皮肤烧伤,骨缺损,神经损伤等等。脊柱裂可沿脊柱的任何部位发生,由于保护脊髓的脊柱骨闭合不全,导致脊髓和神经的损伤,显性脊柱裂还伴有病变部位的皮肤缺损。因此利用组织工程技术,制作双层支架,分别来修复病变部位的皮肤缺损以及神经损伤有广阔的应用前景。
本文利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞分别种植在纤维蛋白胶支架、壳聚糖-明胶支架上,寻找合适的种子细胞浓度,培养条件并探寻BMSCs在壳聚糖.明胶支架上向神经方向分化的可能性,最后在体外用纤维蛋白胶、壳聚糖-明胶支架构建用于治疗先天显性脊柱裂的复合支架,为体内移植打下基础。
实验材料与方法：
1、实验材料试剂与主要仪器
实验主要材料包括壳聚糖-明胶支架(天津中医药大学提供),人血纤维蛋白原(上海莱士),凝血酶(sigma),抑肽酶(上海源叶公司),胎牛血清(Hyclone),DMEM-F12(Hyclone),倒置相差显微镜(德国Leica),共聚焦扫描电子显微镜(德国Leica)
2、实验方法
选取四周龄体重在100g左右的SD大鼠,分离提取原代的骨髓间充质干细胞,待传代传至P3以上,冻存备用。选取孔隙率较高,孔径均匀的壳聚糖-明胶材料,将BMSCs以合适的浓度接种其上,联合培养2天左右,待细胞在支架上状态稳定后,加入20ng/ml的BDNF使其向神经方向分化。探索合适的纤维蛋白原以及凝血酶浓度,接种的种子细胞浓度,为下一步的体内移植打下基础。
实验结果：
1、骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养
分离出骨髓间充质干细胞,原代培养24h,大部分细胞贴壁生长,2天后第一次换液,可以观察到细胞成簇生长。5天左右可以观察到细胞集落差不多融合长满瓶底,可以传代,其后大概每两天传代一次,P3以后的BMSCs纯度可达90%以上。
2、壳聚糖-明胶支架、纤维蛋白胶支架的表征
观察到壳聚糖-明胶支架内部孔径均匀一致,互相连通,孔径多在300-400μm左右,孔隙率在90%以上,可为BMSCs提供一个很好的良好的生存空间。纤维蛋白胶表面由较为致密的纤维搭建而成,内部为一些不规则的多孔。随着纤维蛋白原浓度的增加,纤维蛋白胶支架的机械强度变大,内部的纤维蛋白网络也更加致密,适合BMSCs生长的最佳条件为凝血酶浓度为50KIU/ml,纤维蛋白原浓度为30mg/ml。
3、骨髓间充质干细胞在两种支架中的存活、增殖和生长
3.1、BMSCs在壳聚糖-明胶支架上的生长情况
经过两周的培养观察,在培养一周时间后对支架进行FDA活细胞染色,发现支架内部和表面均有大量的活细胞生长,且生长状态良好。两周后取材做电镜及HE染色,电镜观察发现支架内部有正处于分裂期的细胞,分泌大量细胞外基质,并伸出伪足,生长状态良好,HE染色发现支架内部细胞彼此连接形成网络,攀附于孔壁上。
使用正常含10%FBS的DMEM-F12的培养基培养壳聚糖.明胶支架复合物两天,再使用含浓度为20ng/mlBDNF的培养基培养一周。对支架进行固定取材,切片,进行nestin染色。在支架上发现nestin阳性细胞,HE染色和电镜下观察到神经干样细胞,神经元样细胞,证明支架BMSCs在支架上可以向神经方向分化。
3.2、BMSCs在纤维蛋白胶支架上的生长情况
选取两种浓度的纤维蛋白胶支架进行细胞培养,光镜下每天观察,选取1天,4天,7天为时间点,观察到在纤维蛋白原浓度为30mg/ml,凝血酶浓度为50u/ml的情况下细胞的生长状态明显好于高浓度组,4天,7天时的细胞增殖明显,高浓度组细胞增殖不明显,HE染色结果有着类似结果。电镜观察细胞在纤维蛋白胶支架上生长状态良好,伸出伪足,分泌大量细胞外基质。
4、壳聚糖-明胶支架与纤维蛋白胶支架的复合
将纤维蛋白胶与壳聚糖.明胶支架复合,复合后的支架可见两种材料结合的良好,结合处纤维蛋白胶深入壳聚糖.明胶内部,将其内部原来的空隙填满,使两种支架之间形成一条隔离带。使得上层细胞不会与下层细胞之间相互影响,但是仍然有营养物质及细胞因子的交流。
结论：
壳聚糖-明胶支架孔隙率达90%以上,孔径在300μm左右,BMSCs在其上可以有序的分布,生长,且可以在细胞因子的作用下向神经方向分化;纤维蛋白胶的孔径相对较小,适合BMSCs生长,且可与壳聚糖.明胶支架形成用于治疗先天显性脊柱裂的复合支架。本研究为应用组织工程支架治疗先天性脊柱裂具有指导一定意义。