【摘 要】
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目的:明确DRAM1在胃癌及相应癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞系中的表达差异,探究DRAM1蛋白在胃癌细胞增殖迁移过程中的作用及可能的作用机制,希望能为胃癌的诊断和治疗提供新的思路和靶点。方法:(1)通过在线数据库分析DRAM1在胃癌和正常胃组织中的m RNA水平,应用qRT-PCR检测临床胃癌组织及相应的癌旁组织中DRAM1的m RNA水平,并用Western blotting技术检测蛋
【基金项目】
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国家自然基金项目(编号:81772157); 镇江市重点研发计划(社会发展)项目(编号:SH2019044);
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目的:明确DRAM1在胃癌及相应癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞系中的表达差异,探究DRAM1蛋白在胃癌细胞增殖迁移过程中的作用及可能的作用机制,希望能为胃癌的诊断和治疗提供新的思路和靶点。方法:(1)通过在线数据库分析DRAM1在胃癌和正常胃组织中的m RNA水平,应用qRT-PCR检测临床胃癌组织及相应的癌旁组织中DRAM1的m RNA水平,并用Western blotting技术检测蛋白水平差异。(2)运用qRT-PCR和Western blotting对正常胃上皮细胞及各胃癌细胞株中DRAM1表达进行差异分析。筛选DRAM1高表达的胃癌细胞SGC-7901转染小干扰RNA(si DRAM1),对表达量相对较低的胃癌细胞HGC-27转染过表达质粒(pcDNA3.1-DRAM1),构建DRAM1体外敲减及过表达细胞模型并验证其效率。(3)通过CCK-8及细胞集落形成实验检测干扰或上调DRAM1表达对胃癌细胞的增殖能力的影响;细胞划痕愈合及Transwell迁移实验观察DRAM1对胃癌细胞迁移的影响;蛋白免疫印迹实验检测上皮间充质转化(EMT)、细胞增殖、迁移相关蛋白以及Wnt/β-catenin通路蛋白,探究DRAM1在胃癌细胞增殖和迁移中的调控作用。结果:(1)荧光定量PCR与Western blotting结果显示:DRAM1在胃癌组织中的表达量普遍高于相应癌旁组织。细胞系蛋白印迹实验结果显示,DRAM1在胃癌细胞中的表达上调,尤其在SGC-7901细胞中表达最高,在HGC-27细胞中表达相对较低。(2)CCK-8增殖实验与细胞克隆形成实验结果显示:降低SGC-7901细胞中DRAM1水平后细胞增殖减弱。通过细胞划痕实验及Transwell迁移实验观察到:敲减DRAM1抑制了SGC-7901细胞的运动能力,细胞迁移显著减弱。Western blotting实验显示:下调DRAM1水平后,SGC-7901细胞中上皮细胞标志性蛋白E-cadherin表达上调,同时伴有间叶细胞标志蛋白Vimentin、N-cadherin蛋白水平降低,说明DRAM1下调抑制了EMT;基质金属蛋白酶MMP2、MMP9及增殖细胞核抗原PCNA显著减少,表明胃癌细胞增殖及迁移受到抑制;通路蛋白GSK3β的变化无统计学意义,β-catenin、Cyclin D1、p-GSK3β、c-Myc表达减弱,表明Wnt/β-catenin信号通路受到抑制。(3)过表达质粒pcDNA3.1-DRAM1转染HGC-27细胞后,细胞功能实验显示胃癌细胞增殖、迁移能力显著增强。Western blotting结果显示:E-cadherin表达减少,Vimentin、N-cadherin水平升高,EMT受到促进;细胞增殖、迁移相关蛋白表达上升;Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白水平升高,表明信号通路受到激活。结论:相较于相应癌旁组织或正常胃上皮细胞,DRAM1在胃癌组织及胃癌细胞系中表达上调。在胃癌细胞中过表达DRAM1可增强细胞的增殖、迁移能力,促进细胞发生EMT;敲减DRAM1抑制胃癌细胞增殖迁移,抑制EMT发生。此外,Wnt/β-catenin信号通路可能为DRAM1促进胃癌的发生发展途径。
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