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十字花科黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)引起的,在世界范围内造成重大危害,引起巨大的经济损失。生物信息学分析显示野油菜黄单胞菌基因组中有较为完整的脂肪酸合成编码基因,然而,至今人们对野油菜黄单胞菌如何合成脂肪酸,特别是该菌的脂肪酸合成系统与DSF类信号分子合成之间的关系知之甚少。为此,本论文研究了野油菜黄单胞菌中3-酮酯酰ACP(acyl-carrier protein,酰基载体蛋白)还原酶的生理功能。研究结果如下:首先,通过同源性分析,在野油菜黄单胞菌ATCC33913基因组中检索到XCC1018和XCC0416基因与大肠杆菌fabG基因具有同源性,分别命名为XccfabG1和XccfabG2。将XccfabG1和XccfabG2连入表达载体后,遗传互补大肠杆菌(Escherichia coli)fabG温度敏感突变株CL104,结果显示XccfabG1具有3-酮酯酰ACP还原酶活性能够互补CL104,XccfabG2则只有在添加有己酸或辛酸,且aasS基因或xccfabH基因共转化的条件下才可以恢复大肠杆菌突变株在非许可温度下的生长。放射性同位素标记的结果表明XccfabG1能够恢复CL104的脂肪酸合成,而添加有辛酸的XccfabG2共转化子也能恢复脂肪酸的合成。其次,将XccfabG1与XccfabG2基因连入表达载体pET-28(b),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化获得XccFabG1与XccFabG2蛋白。体外构建脂肪酸合成反应,非变性PAGE电泳分析,结果显示XccFabG1能催化所有链长的3-酮酯酰ACP,还原为3-羟基脂酰ACP。XccFabG2对短碳链的3-酮基丁酰ACP活性极低,但能够还原中长链3-酮酯酰ACP。酶活性测定结果显示XccFabG2对3-酮基丁酰ACP的活性比XccFabG1低14倍,而对3-酮基癸酰ACP和3-酮基月桂酰ACP的活性要比XccFabG1高一倍左右。当底物为3-酮基癸酰ACP时,XccFabG2对辅因子NADPH的亲和力更高,酶活力更强。第三,尝试构建两个3-酮酯酰ACP还原酶基因的突变菌株,仅得到XccfabG2的突变菌株。直接敲除未得到XccfabG1的突变菌株,过表达XccfabG2后,添加辛酸得到XccfabG1的突变菌株。检查突变株的生长发现,XccfabG1的突变菌株只能在添加有辛酸或己酸的培养基中生长。分析XccfabG1和XccfabG2的表达水平,发现XccfabG2的表达水平远低于XccfabG1,导致总体的3-酮酯酰ACP还原酶活性过低无法完成脂肪酸合成反应。各突变株及回补菌株的脂肪酸组成有所变化,但变化不大。最后,DSF信号分子检测结果显示,XccfabG2突变株信号分子降低,其中DSF的含量降低75%,而BDSF降低了45%,回补菌株DSF类信号分子的合成恢复到野生型水平。这表明XccfabG2影响信号分子的合成。XccfabG的启动子区域能被全局调控蛋白Clp结合,其表达水平在clp突变株中提高,在clp突变株的回补菌株恢复到野生型的水平。而在rpfG、rpfF、rpfC的突变菌株中,XccfabG的表达水平也有所提升。综合以上结果,在革兰氏阴性细菌ATCC33913中Xcc FabG1是野油菜黄单胞菌的主要3-酮酯酰ACP还原酶,参与脂肪酸合成。Xcc FabG2一种新型的3-酮酯酰ACP还原酶,具有中长链的3-酮酯酰ACP还原酶的活性,其主要功能可能与野油菜黄单胞菌的信号分子合成相关。