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目的： 1.在TaqMan探针法实时荧光定量PCR中，以乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）为研究对象，排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题，减轻气溶胶的污染程度和引物二聚体（Primer Dimer，PD）的干扰程度； 2.使用新型探针及引物建立新型检测体系，并对所建方法进行应用评价； 3.对探针法双重PCR成份进行分析，并指出其中影响靶模板检测灵敏度的主要因素。 方法： 1设计普通TaqMan探针HBVP1、新型TaqMan-分子信标探针HBVP2、HBVP3和引入反义碱基的新型探针 HBVP4，分别对四种探针进行引物探针聚合试验，并比较不同反应条件（仪器热盖和矿物油封闭情况）；对比四种探针的淬灭效率和应用于质粒检测时的灵敏度；在双重 PCR中，对共用一对引物的不同模板进行竞争性干扰试验，对不共用引物模板进行非竞争性双重PCR，观察其出现干扰作用的浓度倍数关系；分别设计管家基因GAPDH、β-globin和Alb的引物，检测其天然浓度，选择合适管家基因作为内标基因。 2.使用优化后的体系，检测梯度系列稀释的HBV质粒，作标准曲线并分析其线性范围和灵敏度；取107 IU/mL、105IU/mL、103IU/mL三个质粒浓度进行重复性试验，计算其变异系数；使用该体系检测HBV和其它DNA病毒阳性样本。收集中国人民解放军总医院肝胆外科、消化内科、查体及其他已有核酸检测结果样本共459例，使用新建体系进行检测。 3.对乙型肝炎病毒基因设计普通引物对和中部同序引物对，比较引物二聚体(Primer dimer, PD)含量；在控制内标基因的Ct值在30左右的情况下，调整内标引物浓度至10μmol/L、8μmol/L、5μmol/L、2μmol/L和1μmol/L，比较不同体系的检测灵敏度；控制内标引物的用量不变，分别测定内标 Ct值在15、20、25、30时靶模板检测的灵敏度。 结果： 1.引物与探针聚合实验中，含有反义碱基的HBVP4在重复试验中未出现假阳性；竞争性双重PCR和非竞争性双重PCR两模板开始出现干扰作用的浓度差分别为20倍和100倍；对于内标基因，使用中部同序引物对以及普通引物对分别可以检测到10-9和10-8稀释度。3种HBV基因检测体系，使用普通引物对可以检测到Ct33左右，加入内标系统和使用中部同序引物对均可检测到Ct35左右。 2.新建体系的线性相关系数达0.997，线性范围为103~108IU/mL，灵敏度为100IU/mL；107、105、103IU/mL三个浓度质粒组内变异系数分别为1.02％、0.81%、0.95%，组间变异系数分别为2.45%、1.72%、1.14%；体系仅能扩增 HBV病毒DNA。检测459例样本，其中有199例呈HBV阳性。 3.中部同序引物PD的Ct值在35以上，普通引物对PD的Ct值在30-33之间；10μmol/L、8μmol/L、5μmol/L、2μmol/L和1μmol/L浓度的内标引物需要内标模板的浓度分别为5×104 IU/mL、5×104 IU/mL、5×104 IU/mL、5×105 IU/mL、5×107 IU/mL；不同内标引物用量检测灵敏度均为5×102 IU/mL，仅使用中部同序引物的单重PCR检测灵敏度为5×101 IU/mL；内标Ct值在15、20、25、30时靶模板检测的灵敏度分别为5×104 IU/mL、5×103 IU/mL、5×102 IU/mL、5×102 IU/mL。 结论： 1.在 TaqMan-分子信标结构调整的基础上引入反义碱基，可以在排除由引物和探针聚合延伸引起的假阳性问题，且对探针的淬灭效率和检测灵敏度无影响；双重 PCR中，使用非竞争性内标系统对靶模板干扰作用较小；在探针法中，使用中部同序引物对和加入内标系统均可降低 PD的干扰程度，提升检测的灵敏度。2.新建HBV检测体系线性重复性好、灵敏度高、特异性强，应用于临床样本检测时准确性高，可以用于大批量样本检测。 3.在双重PCR检测体系中，对靶模板检测灵敏度影响最大的因素为内标的模板量，仅使用中部同序引物对的单重PCR灵敏度最高。