番茄ANT基因家族的鉴定及SlAIL1-2基因的功能研究

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ANT (AINTEGUMENTA)转录因子家族是植物特有的一类DNA结合蛋白,它能够在转录水平上调节基因的表达。ANT家族属于AP2/ERF中的AP2亚家族,AP2家族蛋白含有2个AP2/ERF结构域,在调节植物生长发育的过程中起着非常重要的作用。番茄(Solanum lycopersicum)是世界性种植的重要品种和加工原料,是茄科作物的重要代表,也是研究肉质果实发育和成熟最重要的模式植物。但目前对番茄中ANT家族基因的功能研究较少。本研究利用全基因组信息从番茄中鉴定了5个ANT基因,分析了其结构特征、系统发育关系、染色体定位及组织表达模式。构建了SlAIL1-2的超表达载体、反义抑制载体和GFP融合表达载体,研究了其在番茄组织中的亚细胞定位,SlAIL1-2对激素的响应,进一步分析其在花器官各个部分和在雌蕊不同时期的表达模式,获得了SlAIL1-2超表达和反义抑制转基因植株,观察了植株的表型,检测了相关基因的表达,初步明确了SlAIL1-2在番茄发育过程中的功能作用。主要实验结果如下:①用拟南芥ANT氨基酸序列作为参考,在番茄全基因组数据库中分别进行同源检索,鉴定出5个番茄ANT同源序列。这些基因分别位于番茄的2,4,5,7和11号染色体上,编码的氨基酸长度介于464aa(SlAIL7)~654aa (SlAIL1-2)之间;分子量大小介于50.70KD~72.00KD;理论等电点位于6.03(SlAIL7)~8.54(SlAIL5)之间;内含子为7~8个。②对番茄ANT家族结构分析发现,5个番茄ANT蛋白都具有两个完全保守的“AP2”结构域(R1和R2),每个结构域含有70个左右氨基酸的高度保守序列;并具备4个特异的元件(motifs):其中2、3、4在R1结构域前,元件1是包括10个氨基酸的插入在R1结构域内。5个番茄ANT蛋白都具有完全保守的结构域。③将番茄ANT家族与拟南芥AP2/ERF家族进行系统发育关系分析发现,基于Boostrap值,不同的AP2/ERF基因被分为3个区组(euANT、basalANT和ERF-like)。与拟南芥一样,番茄ANT家族具有高度保守的两个AP2/ERF结构域,属于euANT分支。④组织表达模式分析表明,ANT基因在番茄各个组织中均有表达,在幼嫩的生长器官中表达量较高于成熟器官。ANT基因在番茄茎、叶中微表达量比较低;在花器官中强烈表达,表达丰度从花蕾到盛开花时期逐渐升高;在果实各发育阶段中,幼果中的表达量较高,在绿熟、转色果、黄果及红果时期的表达量较低。⑤克隆了SlAIL1-2,生物信息学分析表明SlAIL1-2编码654个氨基酸;启动子预测其与热胁迫响应、水杨酸响应、分生组织以及与光照相关过程相关;成功构建了GFP融合表达载体,分析表明SlAIL1-2定位在细胞核中;在对各种激素的响应中,KT和ABA处理下SlAIL1-2表达有明显提高。⑥对SlAIL1-2在花器官中四个部分(萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊)以及不同时期雌蕊中的相对表达量进行检测,结果显示SlAIL1-2主要在雌蕊中表达,在授粉当天表达量最高,此后逐渐减弱。⑦为进一步了解SlAIL1-2的功能,观察了SlAIL1-2超表达和反义抑制植株的形态学特征,发现SlAIL1-2抑制表达导致叶片形态和颜色变化,果实果皮颜色变化。同时检测了番茄红素代谢过程相关酶基因的表达,发现SlAIL1-2影响番茄叶片和果皮颜色的调控。
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