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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒引起的一种重要传染病。近年来该病在我国再次暴发和流行,对我国养猪业造成巨大经济损失。猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒,该病毒gB、gC和gE等囊膜蛋白与病毒毒力和免疫保护作用密切相关。本研究采用原核表达系统表达了 PRV gB、gC和gE蛋白基因片段,研制获得针对PRVgC和gE蛋白的两株单克隆抗体,并初步鉴定其B细胞抗原表位。具体内容如下:1.PRV囊膜蛋白gB、gC和gE基因原核表达与鉴定:根据PRV ZJ01毒株基因序列,设计gB、gC和gE基因PCR引物,扩增获得gB1、gB2、gC1、gC2和gE基因片段,大小为 514bp、916bp、874bp、614bp 和 625bp。将gB1、gB2 和 gE 基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32aM,将gC1和gC2基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建获得5个重组质粒,分别转染至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE结果显示,gB1、gB2和gE重组蛋白分子量分别约为40 kDa、40kDa和50kDa,并且主要以可溶形式存在。gC1和gC2重组蛋白分子量约为35 kDa和37 kDa,主要以包涵体形式存在。Western blotting结果表明,gB1、gB2、gC1、gC2和gE重组蛋白与PRV的阳性血清发生良好的反应,具有特异性反应原性。2.两株抗PRV单克隆抗体的制备:本研究采用PRV ZJ01毒株纯化病毒粒子免疫Balb/c小鼠,采用间接ELISA检测技术与细胞融合技术,成功制备两株具有稳定的分泌抗PRV单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株2B3和5C10,其中,2B3单抗为IgG2a亚类,5C10为IgG1亚类,轻链均为κ链。间接免疫荧光检测结果表明,两株单克隆抗体均能与PRV发生特异性反应。Western-blot结果表明,2B3单抗针对PRV gC蛋白,5C10单抗针对PRVgE蛋白,ELISA抗体效价分别为1:8192、1:1:163840,传代15次稳定。为建立快速检测伪狂犬病毒感染免疫学方法奠定了基础。3.两株PRV单克隆抗体B细胞抗原表位的初步鉴定:采用PCR方法将PRV gC和gE蛋白基因分别以7个和5个基因片段克隆至原核表达载体,以His为目的蛋白标签,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,7个gC基因截短体和5个gE基因截短体蛋白均获得成功表达。采用2B3和5C10单抗,通过Western blot检测PRV gC和gE基因截短体重组蛋白,结果显示,gC单抗2B3识别的抗原表位位于340aa～366aa,gE单抗5C10识别的抗原表位位于195aa～207aa,为PRV诊断和gC、gE蛋白功能研究提供了平台。