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针对神经根型颈椎病、椎间盘突出等疾病，西药治疗中抗炎、镇痛治疗及营养保护神经的药物治疗应用已经非常广泛，但是伴随而来的是效果并不理想，产生的副作用也越来越多。因此，人们将目光转向了天然产物，期望从植物资源中寻找安全、有效的单体物质。近年来众多学者展开了相关的中医药药物与临床研究，但是神经根型颈椎病、椎间盘退变的病因学及发病机制仍不清楚，为进一步探索神经根型疾病的发病机理深，同时寻找能有效治疗并防止椎间盘病变的新药，本研究围绕丹参酮ⅡA开展了研究。 丹参酮ⅡA(TSA)是从传统的中药丹参中提取的一个重要的亲脂性双萜。它广泛用于多种疾病的治疗，如心血管病、脑血管病和更年期综合征。丹参酮ⅡA(TSA)在不同的细胞中展示出抗炎能力，如RAW264.7细胞，BV-2细胞，和破骨祖细胞。同时，在不同的动物模型中也可观察到其有效的抗炎作用。此外，更多的研究证明，除了它强有力的抗炎效应，TSA还能通过其抗氧化和抗凋亡属性产生一系列的生化效应。但是，丹参酮ⅡA对神经根性疼痛的研究尚未见报道，是否是通过化学神经根炎学说发挥抗炎作用、保护神经纤维仍不明确。因此，丹参酮ⅡA是否具有和丹参注射液一样的药理功效，可以治疗神经根型疾病及减轻神经根性疼痛。 研究目的： 在本研究旨在探讨丹参酮ⅡA对椎间盘细胞的炎症介质的调控作用研究，分析丹参酮ⅡA的止痛效能及是否参与了NF-κB/p38/JNK信号通路转导发挥抗炎镇痛作用，论证丹参酮ⅡA在退行性椎间盘疾病中治疗炎症反应和减轻神经根性疼痛的潜力，为开发新药提供参考意义。 第一部分:丹参酮ⅡA对椎间盘细胞的炎症介质的调控作用研究 方法:通过体外细胞实验，探究丹参酮ⅡA(TSA)的抗炎，抗代谢作用，探讨TSA治疗椎间盘疾病的潜能。(1)体外培养椎间盘细胞，MTT比色法和BrdU核素掺入法评估TSA对椎间盘细胞生存活性及增殖状况的影响，筛选TSA干预的最佳剂量。(2)体外细胞实验分为实验组和对照组。实验组椎间盘细胞给予IL-1β刺激，对照组则不给任何刺激，分别给予TSA和DMSO进行干预治疗。采用ELISA试剂盒、实时定量PCR、免疫印迹Western-blot等检测手段检测各组椎间盘细胞的白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、toll样受体2(TLR2)、神经生长因子(NGF)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶2(COX-2)的含量及活性表达情况。(3)了在表达层面鉴定受p38 MAPK调节的炎症相关分子，本研究以p38-MAPK抑制剂SB239063作为对照，IL-1β预刺激细胞与TSA或SB239063共同处理，18小时后检测各组MMP1、MMP13、iNOS和COX-2的mRNA表达。进一步探究丹参酮ⅡA潜在参与的相关信号转导通路途径，为后续动物实验奠定基础。 结果:(1)体外培养人椎间盘细胞中TSA用量实验中，MTT和BrdU核素掺入结果显示，5μM TSA对体外人椎间盘细胞的生存活性及增殖有促进作用，本研究将采用5μM TSA进行后续实验。 (2) ELISA结果显示，在IL-1β刺激下，人椎间盘细胞MMP1和MMP13的表达较空白对照组显著上调(P＜0.05)，给予TSA干预后，IL-1β诱发的MMP1和MMP13活性明显被抑制，其表达量显著下调(P＜0.05)。空白对照组椎间盘细胞由于无IL-1β刺激，未诱发炎症反应，给予TSA或是DMSO干预，MMP1和MMP13活性均无变化。TSA对炎性因子IL-1β诱导的MMP1和MMP13活性升高有抑制作用。 (3) RT-PCR和Western-blot结果显示，TSA能显著抑制IL-1β诱导的椎间盘细胞MMP1和MMP13的mRNA和蛋白质水平上调，与给予DMSO实验组比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。TSA通过下调MMP1和MMP13的mRNA和蛋白质水平，可以抑制IL-1β激活的炎症反应。 (4)体外椎间盘细胞炎性介质实验中，在IL-1β刺激后，椎间盘细胞炎症因子及相关活性分子，白介素(IL-6，IL-8)、toll样受体2(TLR2)、神经生长因子(NGF)的mRNA表达较空白对照显著增加(p＜0.05)，给予TSA处理后，IL-6、IL-8、TLR2及NGF的mRNA表达明显下调，趋近于正常水平，炎症反应被抑制，炎性因子分析调节失衡得到逆转。在IL-1β刺激下，椎间盘细胞参与炎症反应的诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶2(COX-2)的mRNA表达明显上调(p＜0.05)，TSA干预后，iNOS和COX-2的mRNA水平显著被抑制(p＜0.05)，iNOS和COX-2合成减少接近空白对照组。与此同时，IL-6ELISA结果表明，IL-1β刺激培养导致椎间盘细胞IL-6分泌释放较对照组增加(p＜0.05);而TSA处理后，分泌到培养基的IL-6蛋白含量显著减少，TSA能显著抑制IL-1β激活的体外椎间盘细胞炎性介质的表达上调。 结论:在体外培养的人类椎间盘细胞中，我们研究了TSA对炎性细胞因子的影响，检测评估了其抗炎效果，及其减少伤害感受性反射和椎间盘相关神经病理性疼痛的作用。实验发现，TSA通过下调椎间盘细胞中炎症和疼痛相关介质IL-6、IL-8、TLR2、GNF、iNOS和COX-2的表达来调控IRAK-1和NF-κB/p38/JNK信号转导通路。虽然TSA在椎间盘细胞中的活动和其直接目标的确切分子机制仍难以确定，我们的实验结果仍能证明其在治疗椎间盘相关炎症和椎间盘退行性变后背部疼痛的具有极大潜力。 第二部分:基于NF-κB/p38/JNK信号通路的丹参酮ⅡA对神经根型椎间盘抗炎作用研究 方法:将60只成年雌性SD大鼠随机分为三组，分别是假手术组(对照组，n=20)，髓核(NP)组织模型组(NP组，n=20)和丹参酮实验组(NP+TSA组，n=20)。模型组和实验组大师构建神经根性疼痛动物模型，步骤如下:采集大鼠尾部自体髓核(NP)作为诱导疼痛的媒介工具。显微镜下行切除术分离出左侧行椎骨关节面暴露出左L5神经根和背根神经节(DRG)，并将自体髓核放置到DRG上，诱导NP调节疼痛。NP模型组给予DMSO作为模型对照(NP+DMSO);实验组则在NP远侧神经外膜下注射0.05 mL的5μMTSA溶液，同时术后每12小时给大鼠灌胃TSA，剂量为30 mg/kg，连续给药21天(NP+TSA)。通过斯普拉格-杜勒鼠行冯·弗雷灯丝试验测试大鼠无害机械刺激敏感性，进而评估TSA对大鼠疼痛行为的影响，探究其治疗效果及可能的作用机制。结合细胞实验中实时定量PCR、免疫印迹Western-blot等检测结果，探讨丹参酮ⅡA的止痛效能及是否参与了NF-κB/p38/JNK信号通路转导发挥抗炎镇痛作用，论证丹参酮ⅡA在退行性椎间盘疾病中抑制炎症反应和缓解神经根性疼痛的作用。 结果:为考察TSA对活体大鼠疼痛行为的缓解作用，本研究采用文献方法成功构建神经根性疼痛动物模型后，行冯·弗雷灯丝实验评估了各组大鼠机械刺激疼痛敏感性。结果显示，假手术组只做椎骨关节面切除术，并未制备神经根性疼痛模型，其机械缩足反射处于正常状态，阈值维持在一个较为平稳的水平，无疼痛行为出现。模型NP+DMSO组背根神经节受NP刺激后，背根神经节神经元胞体兴奋性增加，进而自发性放电增加，从而引起疼痛感觉阈值降低和触摸痛等神经病理性疼痛症状，机械缩足反射阈值较S组显著下降三分之二。实验NP+TSA组经TSA处理后，炎症反应及细胞因子过度活化受到抑制，冯·弗雷灯丝实验中机械缩足反射阈值回升，且阈值恢复到假手术组水平。 结论:模型组大鼠在骸核NP诱导下，背根神经节神经元胞体兴奋性增加，炎性因子和生物活性分子被过度激活后大量释放，介导信号转导，加剧了械刺激疼痛敏感性。因此，大鼠机械缩足反射阈值与假手术组相比显著减低，疼痛行为增加。给予TSA干预治疗后，实验NP+TSA组大鼠炎症反应及细胞因子过度活化受到抑制，大鼠机械缩足反射阈值较模型组回升，并恢复至假手术组正常水平，大鼠神经根性疼痛得到缓解。综上所述，TSA能介导NP组织诱导的炎症反应，阻止机械缩足反射阈值下降，进而能减缓椎间盘相关神经根病变的发展，具有良好的镇痛作用。结合前期椎间盘细胞实验结果，和体外细胞培养观察到的机制相似，本研究推测TSA可能通过抑制细胞因子和疼痛相关炎症介质IL-6、IL-8、TLR2、GNF、iNOS和COX-2的表达，介导IRAK-1和NF-κB/p38/JNK信号转导通路，减轻动物的疼痛行为。