【摘 要】
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基因治疗是一种新兴的医疗手段,有望从根本上治疗先天性遗传和后天获得性疾病,然而,低毒、高效、稳定的基因载体的制备是限制其发展的一个关键因素。病毒类载体转染效率较高,
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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基因治疗是一种新兴的医疗手段,有望从根本上治疗先天性遗传和后天获得性疾病,然而,低毒、高效、稳定的基因载体的制备是限制其发展的一个关键因素。病毒类载体转染效率较高,但是存在严重的安全隐患。非病毒基因载体具有成本低、结构多样、易于修饰实现多功能化、安全无免疫原性等优点,引起了科研学者的极大兴趣。聚乙烯亚胺是迄今研究最多也是最为有效的非病毒基因载体材料之一,尤其是超支化的分子量为25K的聚乙烯亚胺(PEI25K),已经成为衡量非病毒基因载体各项性能的“黄金标准”。但是,其生物不可降解性、高电荷密度导致的高细胞毒性、与病毒载体相比依然较低的转染效率等限制了其临床应用。在本论文工作中,分别通过交联寡聚乙烯亚胺和修饰PEI25K制备了简单的聚乙烯亚胺衍生物。
一方面,本文用可降解的六氯环三磷腈交联小分子量的寡聚乙烯亚胺,得到了不同分子量的聚合物。测试表明,交联聚合物具有较强的DNA担载复合能力,形成了粒径为150nm、表面电荷为30～40mV稳定的纳米复合物颗粒,能够有效地传递基因,其最佳转染效率为商品化的PEI25K的3倍,而细胞毒性却比同浓度的PEI25K小得多,具有可降解、低毒、高效的优点。
另一方面,本文用N-异丙基丙烯酰胺或者丙烯酰胺通过Michael加成反应对PEI25K进行了修饰,并用1HNMR、TNBS方法表征确定了聚合物结构。酸碱滴定法测试了聚合物的缓冲能力,在不同pH范围内呈现不同的变化趋势。凝胶阻滞电泳实验证明聚合物具有较强的DNA结合能力。粒径电位分析表明聚合物与DNA形成了粒径在130～150nm,表面电位为25～40mV的纳米复合物颗粒。MTT实验测试了聚合物的细胞毒性比同浓度的PEI25K小得多。而体外转染实验表明聚合物具有很高的基因转染效率,尤其是N-异丙基丙烯酰胺修饰的聚合物极大地提高了基因转染效率。进一步通过流式细胞仪和激光共聚焦观察到N-异丙基丙烯酰胺修饰的聚合物不仅具有极高的细胞内吞效率,而且具有较强的进入细胞核的能力。N-异丙基丙烯酰胺修饰的聚合物不仅合成简单,降低了细胞毒性,而且极大地提高了基因转染效率,还具有很强的进入细胞和细胞核的能力。
总之,本文通过六氯环三磷腈交联寡聚乙烯亚胺、N-异丙基丙烯酰胺或者丙烯酰胺修饰PEI25K均降低了材料的细胞毒性并提高了基因转染效率,而且合成简单,具有良好的应用前景。
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