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背景:伊马替尼(imatinib,IM)等酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)可以特异性抑制BCR-ABL1融合基因产物活性,从而抑制肿瘤细胞增殖。但20%~30%患者服药后出现TKI耐药,主要原因之一是BCR-ABL1激酶结构域(kinase domain,KD)出现点突变。目前常用Sanger测序法(Sanger sequencing,SS)检测融合基因突变位点,但其敏感性较低,无法识别突变丰度低于15%~20%的低水平突变,同时不能分析多个突变种群的克隆结构。二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)通过增加测序通量,检测突变灵敏度可达1%以上,并且在多数情况下能揭示复杂的克隆纹理。目的:1.研究NGS技术能否准确检测慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者BCR-ABL1 KD低水平突变,建立检测BCR-ABL1融合基因突变高灵敏度的新方法;2.进一步揭示多突变种群的克隆结构,并讨论这种高敏感度的基因突变检测方法与临床相关性。材料与方法:收集我院22名经TKIs序贯治疗失去主要分子学反应(MMR:BCR-ABL1≤1%IS)的CML患者外周血样本40例/次进行分析。(1)取患者外周血2ml,Trizol法提取总RNA,逆转录成cDNA后采用PCR扩增BCR-ABL1KD,回收纯化PCR产物。(2)分别采用SS和NGS两种测序方法检测BCR-ABL1KD基因突变,比较两者的差异并分析突变基因的克隆演变及TKIs耐药的相关性。(3)采用TA克隆技术对特殊样本进行直接测序,验证克隆群体的复杂性(复合突变与多克隆突变)。实验数据均采用SPSS19统计软件进行数据分析处理,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.NGS共检测出12种与TKIs临床耐药相关突变,分别为:M244V、Y253H、E255A/K、E292V,V299L,T315I,F359C/I,F317L,H396R,C475Y;SS共检出8种耐药相关突变:E450A/K,F359C/I,T315I,V299L,Y253H,M244V。2.7例样本经SS检测阴性而NGS检测出10处点突变,丰度在1.20%~33.18%,其中8个突变丰度已超出Sanger测序检测的最低阈值(15%~20%),表明NGS敏感度明显高于SS(P<0.05)。3.在12例多个突变样本中发现至少8例属于复合突变,其中发现两种未曾报道的复合突变:F359C/E450A和T315I/E450A。结论:1.SS法可导致样本BCR-ABL1融合基因突变分类错误或低估,其中丰度在1%~15%的基因突变可经NGS法检测。2.通过NGS对ABL1激酶结构域突变动态监测及其克隆演变,早期预测TKI的治疗反应,为患者早期更换药物行个体化治疗提供依据。