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背景与目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症是人类最常见的酶缺陷病之一,全球约有4亿人受累。高发地区为非洲、东南亚和地中海沿岸国家等。在我国南方地区也较多见,G6PD突变携带率高达16%。G6PD缺乏症主要是由于G6PD基因发生点突变所引起的,目前已经发现了160多种致病点突变。主要临床表现有蚕豆病、先天性慢性非球形细胞溶血性贫血(CNSHA)、新生儿黄疸、药物或感染所导致的急性溶血。世界卫生组织(WHO)规定G6PD酶活性为衡量G6PD缺乏症严重程度的重要指标。G6PD缺乏症为X连锁不完全显性遗传病,主要累及男性个体,男性半合子G6PD酶活性缺乏显著；对于女性纯合子或者双杂合子也可发病；而女性杂合子酶活性有较大的变异度,一般情况下受累者无临床表现,但研究发现部分杂合子也可表现为酶缺乏、蚕豆病、溶血性贫血等临床症状,这种现象尚不能从经典的G6PD突变机制中得到解答。G6PD基因的表达主要受该基因的特殊突变类型、外显子剪接沉默子、转录因子及表观遗传学等方面的调控。对于女性杂合子来讲,DNA甲基化和X染色体失活或许对其G6PD酶活性异质性的现象起着主要的作用。DNA甲基化,特别是靠近转录起始位点的CpG岛的高甲基化状态,可以沉默基因的表达,并发现与某些疾病的发生、发展有密切的联系。Toniolo等研究证实小鼠的G6PD基因5’启动子区域的甲基化可以调控该基因的表达,在失活的X染色体上G6PD基因部分位点是甲基化的,而在未失活的X染色体上G6PD基因5’端的部分CpG位点是未甲基化的。然而人类的全基因组甲基化或G6PD基因的甲基化对G6PD缺乏症表型的影响鲜有报道。另一方面,由于人类X染色体的随机失活,女性杂合子的体细胞通常被认为是一个嵌合体。在某些情况下,X染色体受遗传因素的影响可以发生非随机失活。携带野生型等位基因的偏移失活通常会引起突变基因的表达,这种女性通常会产生如男性突变半合子的酶缺乏症状。因此,我们假设X染色体的非随机失活是导致同种基因型的女性杂合子酶活性各异的关键所在。虽然也有前人报道称X染色体的偏移失活是导致老年女性杂合子酶缺乏的重要原因。然而他们并没有验证失活的X染色体所携带G6PD基因是突变型还是野生型。迄今为止,尚未有大人群的研究证实X染色体失活与G6PD缺乏症表型的关系。因此,造成G6PD杂合子表型异质性的原因还需进一步的深入研究。本研究主要是采用甲基化敏感性内切酶HpaⅡ/MspⅠ结合荧光偏振的检测方法对全基因组DNA甲基化进行定量；采用重亚硫酸氢钠处理DNA后测序的方法定量G6PD基因启动子区15个CpG位点的甲基化；并通过毛细管电泳检测基因型相同而酶活性异质性的G6PD突变女性杂合子的X染色体失活类型,继而分析DNA甲基化及X染色体失活与G6PD酶活性之间的关系。本研究旨在为进一步阐明DNA甲基化及X染色体失活对G6PD酶活性的影响,为临床上该类疾病的诊断、预防和治疗提供参考,同时也为其他X连锁疾病的研究提供借鉴。材料与方法1.研究对象：从珠海市妇幼保健院收集到基因型、酶活性已知的家系DNA样本139例,每个家系中包括1个G6PD女性杂合子及其儿子,其中,女性杂合子年龄段为21-43岁,其基因型为c.1376G>T68例,c.1388G>A71例。从东莞市妇幼保健院随机收集到212例女性血液样本,经G6PD活性测定及G6PD基因型检测、测序共得到基因型野生型、酶活性正常的健康样本167例,其中新生儿组53例,18-59岁65例,老人组66例。2.G6PD酶活性、基因型检测：对于家系样本,酶活性及基因型指标分析由珠海市妇幼保健院完成。对于随机收集的212例女性血液样本,通过G6PD/6PGD比值法检测G6PD酶活性,酚/氯仿法提取血液DNA,变性高效液相色谱法(PE/DHPLC)检测G6PD常见突变型,对于检测峰型异常的酶活性正常样本通过DNA测序排除未知突变。本研究通过医院伦理委员会批准,受试者均签署知情同意书。3.分子分析方法：(1)DNA总甲基化的定量检测：139例女性杂合子及167例不同年龄段的正常女性样本通过采用甲基化敏感性内切酶HpaⅡ/MspⅠ结合荧光偏振的检测方法对全基因组DNA的5’-CmCGG-3’处的甲基化进行定量。120ng基因组DNA经甲基化敏感性限制性内切酶HapII及甲基化不敏感性限制性内切酶MSP I酶切,酶切后的DNA与荧光标记的dCTP结合后通过荧光偏振技术检测,则全基因组甲基化可通过下列公式得到：(1-HpaⅡMspⅠ)×100%。(2)G6PD启动子区CpG甲基化的定量检测：首先选取靠近转录起始位点的一段富含CpG位点的序列,设计引物。将所有的女性样本经过重亚硫酸氢钠处理的DNA通过引物扩增,使得没有发生甲基化的C变为U继而扩增变为T,而甲基化的C保持不变。因此扩增产物中待测CpG位点处等位基因C的出现概率即为甲基化的程度。经测序,计算该位点C和T的峰面积比,即可定量该位点的甲基化值。(3)X染色体失活类型的检测：本研究采用雄激素受体基因(AR).分析方法检测女性杂合子及18-60岁的女性对照样本的X染色体失活类型。Hpa II酶切的基因组DNA经AR及内参基因MIC2的双重PCR扩增,产物经毛细管电泳分析检测。对于家系样本,根据儿子的基因型及扩增产物的长度,连锁分析判断母亲的哪条等位基因为野生型,将该野生型等位基因设为I,则另一条等位基因为II；对于健康女性样本,设扩增片段较长的等位基因为I,则另一条等位基因为Ⅱ。那么,X染色体失活类型=峰面积Ⅰ/(峰面积I+峰面积Ⅱ×E),其中E作为消除等位基因之间大小及结构造成的扩增效率不同的校正因子,该校正因子通过计算未经Hpa II酶切处理的样本的两条等位基因的扩增效率获得：E=峰面积Ⅰ/峰面积Ⅱ。4.统计学分析：(1)以下4种分析比较采用曼-惠特尼U检验：a.不同年龄组健康女性的全基因组DNA甲基化的两两比较；b.G6PD酶正常的女性杂合子及酶缺乏的女性杂合子的全基因组DNA甲基化的比较；c.不同年龄组健康女性的G6PD启动子区15个CpG位点甲基化的两两比较；d.G6PD酶正常的女性杂合子及酶缺乏的女性杂合子的G6PD启动子区15个CpG位点甲基化的比较。(2)G6PD酶正常的女性杂合子、酶缺乏的女性杂合子及正常对照组的X染色体失活类型的分布状态的不同采用Fisher精确检验；(3)DNA总甲基化、G6PD启动子区CpG位点甲基化、X染色体失活程度与G6PD/6PGD比值相关性分析采用spearman秩相关检验；(4)采用非条件logistic回归方法分析影响G6PD缺乏症的相关因素。以上统计学分析采用SPSS13.0(SPSS Inc. Chicago, USA)软件进行数据处理,检验水准a=0.05,以p<0.05提示差异有统计学意义。研究结果(1)DNA总甲基化检测结果为了检测DNA甲基化与年龄的关系,53例新生儿、65例成年人(18-59岁)以及66例60岁以上老年女性DNA全基因组甲基化定量检测结果显示,新生儿组总甲基化水平显著高于成人组(0.97±0.29VS.0.87±0.20,p=0.011)；老人组的总甲基化水平也显著高于成人组(1.00±0.28VS.0.87±0.20,p=1.63E-4)；但新生儿组与老人组的总基化水平并没有显著性的差异(0.97±0.29VS.1.00士0.28,p=0.395)。为了进一步探讨甲基化对G6PD酶活性的影响,68例G6PD酶正常女性杂合子、71例酶缺乏的女性杂合子经总甲基化定量,结果显示同种突变基因型的酶缺乏的女性杂合子的总甲基化水平显著高于酶正常的女性杂合子(1.14±0.18VS.0.93±0.28,p=0.001(c.1376G>T);1.14±0.30VS.0.94±0.28,p=0.046(c.1388G>A)).并且同种突变基因型的G6PD女性杂合子的总甲基化值与G6PD/6P GD比值呈显著负相关(r=-0.465,p=6.40E-5(c.1376G>T);r=0.668, p=1.59E-4(c.1388G>A)).可发现甲基化与年龄密切相关,并且DNA高甲基化状态可降低G6PD酶活性。(2)G6PD启动子区甲基化检测结果为了检测G6PD启动区CpG甲基化是否与年龄有关及其对G6PD酶活性的作用,我们选择靠近G6PD基因转录起始位点TSS上游-15～-200bp处的15个CpG位点做特异位点的甲基化检测。所得甲基化结果经曼-惠特尼U检验统计分析发现：新生儿组的CpG甲基化水平在G6PD启动子区15个位点中有9个位点显著的高于18-59岁年龄组的甲基化(CpG2,3,4,5,7,8,9,12及13)；老人组的CpG甲基化水平在G6PD启动子区15个位点中有11个位点显著的高于18-59岁年龄组的甲基化(CpG1,2,3,4,5,6,7,10,11,12及13)；15个位点中除了CpGl的甲基化水平是老人组高于新生儿组外,其他位点的甲基化水平在两组之间均没有显著性差异。对71个酶缺乏女性杂合子及68个酶正常女性杂合子的DNA样本进行CpG甲基化检测发现：c.1376G＞T突变组中,酶缺乏女性杂合子的CpG甲基化水平在G6PD启动子区15个位点中有4个位点显著的高于酶正常女性杂合子的甲基化,这4个位点分别为CpG6,12,13和14；c.1388G>A突变组中,酶缺乏女性杂合子的CpG甲基化水平在G6PD启动子区15个位点中有8个位点显著的高于对照组的甲基化(CpG1,8,10,11,12,13,14和15)。将本分析中甲基化值有统计学差异的CpG位点纳入后续相关统计分析,结果显示：c.1376G>T突变组中CpG12和CpG14的甲基化值与G6PD/6PGD值呈显著性负相关(r=-0.298和-0.266)；c.1388G>A突变组中,共有7个位点(CpG1,10,11,12,13,14和15)的甲基化值与G6PD/6PGD值呈显著性负相关(r=0.347,-0.311,-0.291,-0.307,-0.322,-0.266和-0.373)。(3)x染色体失活类型检测结果本实验共检测了65个健康对照组、68个酶正常女性杂合子及71个酶缺乏女性杂合子的x染色体失活类型。研究发现在139例G6PD女性杂合子中携带有G6PD正常等位基因的x染色体失活类型的范围是4.01%-97.28%(mean±SD=54.66±21.95%)。按照G6PD突变类型将本研究中的女性杂合子分为两组,做Spearman’s相关分析发现携带有G6PD正常基因的x染色体失活程度与G6PD/6P GD的比值成显著负相关：r=-0.657,p=5.13E-9(c.1376G>T);r=-0.668,p=1.24E-9(c.1388G>A)。又G6PD/6PGD比值与G6PD酶活性成正比,即携带有G6PD正常等位基因的x染色体失活越多G6PD酶活性越低,酶缺乏程度越严重。通过多因素logistic回归分析总甲基化值、G6PD启动子区特殊CpG位点的甲基化值及携带有G6PD野生型等位基因的x染色体失活类型是否为G6PD女性杂合子发生酶活性缺乏的危险因子。c.1376G>T突变组中,CpGl2的甲基化值(OR1.10,95%CI1.03-1.17,p=0.004)与携带野生型G6PD的x染色体失活类型(OR1.1l,95%CI1.05-1.17,p<0.001)被纳入多元logistic回归模型,说明这两个因素对G6PD酶缺乏有决定作用。同样在c.1388G>A突变组,CpG15的甲基化值(OR1.05,95%CI1.01-1.09,p=0.023)与携带野生型G6PD的x染色体失活类型(OR1.06,95%CI1.02-1.10,p=0.001)被纳入logistic回归模型,说明这两个因素为女性杂合子G6PD酶缺乏的危险因子。并且甲基化值越高,携带野生型G6PD的x染色体失活越多,G6PD酶缺乏症发生率风险越高。结论本研究发现DNA甲基化状态与年龄密切相关：新生儿及老人组的甲基化值显著地高于成人组甲基化值。DNA的高甲基化状态,特别是G6PD启动子区的高甲基化状态以及G6PD野生型等位基因的优先失活都可以降低G6PD女性杂合子的酶活性,导致酶缺乏。经多因素Logistic回归发现,CpGl2或15的高甲基化及G6PD野生型等位基因的优先失活为G6PD女性杂合子酶缺乏的危险因子,说明DNA的高甲基化状态及X染色体优先失活是引起G6PD女性杂合子酶活性异质性的关键所在。