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研究背景胃腺癌是胃癌的一种,源于胃腺体细胞恶化,占全部胃癌发病率的95%。早期诊断可明显改善癌症治疗效果,但现实却是由于缺乏早期诊断手段,往往就诊时多数患者已经处于局部晚期或发生了远处转移从而延误了病情,错失最佳的治疗时机。血清肿瘤标志物以其简便、快捷、无痛苦等优点,成为胃癌患者的理想检查指标,目前临床常见的胃癌辅助诊断中有癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)及糖类抗原199(CA19-9)。尽管多种肿瘤标志物联合检测能够在一定程度上提高早期胃癌诊断的敏感度,可用于预测患者的病情进展和预后,但检测重复性不佳。组合应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、高效液相色谱(HPLC)及基质辅助激光解析附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,课题组前期曾成功在乳头状甲状腺癌及乳腺癌中寻找特异性标志物,对相关肿瘤早期诊断及预后检测有参考意义,但前期实验存在以下问题:a)血清特异性标志物未与临床在使用的肿瘤标志物做对比;b)特异性标志物未排除炎症干扰;c)血清分析测试前各种影响因素存在偏差,且相互不独立,影响检验效能。尽管近年来分子生物标志物的发现急剧增加,但将这些生物标志物进行临床转化仍存挑战。多肽类药物由于具有不蓄积中毒、相对成本低、生物活性强、副作用小、作用靶点专一等优点,日渐引起制药企业及学术界的关注。本研究拟分为以下两部分进行:第一部分:联合利用SELDI-TOF-MS,HPLC,MALDI-TOF-MS及MALDI-TOF/TOFMS技术对胃腺癌患者术前、术后、复发、对照及全身炎症反应综合征(SIRS)患者血清中的蛋白质组进行筛选、分离纯化及鉴定,最大程度排除炎症因子的干扰,且严格把控血清分析测试前各种影响因素均一性,然后通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)及蛋白质免疫印迹(WB)实验进行验证,最后通过ROC曲线及Kaplan-Meier生存分析方法把筛选出来的非炎性特异性标志物与3个胃癌传统肿瘤标志物CEA,CA19-9及CA125进行诊断及预后效能对比;第二部分:人工合成非炎性特异性标志物,通过体内、体外实验,探究其对胃腺癌的生物学行为影响,并进行作用机制探索,为生物靶向治疗提供理论基础。研究目的筛选并鉴定可用于胃腺癌诊断的血清非炎症性特异性标志物,并进行人工合成,探究其对胃腺癌的生物学行为影响,并进行作用机制探索,为生物靶向治疗提供理论基础。材料与方法1临床资料共收集492份血清样本,其中探索组380份,包括120例胃癌术前血清、106例术后血清、30例胃癌复发血清,64例对照血清(17例胃炎血清、47例正常体检血清)及60例SIRS患者治疗前血清,均来自郑州大学第一附属医院,测试组112份,包括60份胃癌术前血清和52例对照血清(19例胃炎血清、33例正常体检血清),均来自郑州大学附属肿瘤医院。同期收集75例胃腺癌上皮组织,75例对照胃上皮组织(15例胃炎、60例正常组织)。2实验方法2.1血清中非炎症差异性标志物的筛选、鉴定、验证及其诊断预后效能评估CM10芯片与胃腺癌术前、术后、复发、对照及SIRS血清血清结合,把干燥的已结合血清蛋白质的芯片放入质谱仪上机检测,通过Proteinchip Software采集原始数据,然后把原始数据导入ZUCIPDAS分析网络服务软件,对初筛数据进行Wilcoxon秩和检验,选择差别显著的蛋白质峰数据进行分析,通过遗传学算法结合支持向量机的方法筛选出约登指数最高的最佳诊断模型。根据SELDI-TOF-MS筛选结果,通过HPLC分离纯化目标差异性标志物,分装每一个分离成分。使用MALDI-TOF-MS质谱仪进行数据采集,找出与SELDI-TOF-MS前期筛选的非炎症性差异蛋白质相同或相似质荷比的蛋白质所在的样品,然后通过MALDI-TOF/TOFMS检测相应酶解肽段的肽指纹图谱数据,通过Mascot搜索软件与Swissprot数据库连接,搜索相匹配的蛋白质。通过WB及ELISA验证非炎症性标志物在胃腺癌术前、术后、复发、对照血清中的蛋白表达。采用ROC曲线及Kaplan-Meier生存曲线分析方法,把筛选的非炎症性血清标志物与胃癌传统使用的肿瘤标志物CEA,CA19-9及CA125做比较,观察非炎症性血清标志物的诊断及预后检测效能。2.2人工合成非炎症性血清标志物并进行性能结构预测采用固相合成法人工合成非炎症性血清标志物,并使用电喷雾质谱(ESI)和HPLC进行验证以确保合成正确且纯度达到要求。从C-端逐个敲除氨基酸以寻找其最短功能片段,同时对非炎症性血清标志物进行性能预测及分析。荧光肽是非炎症性血清标志物N端标记FITC绿色荧光。2.3体外实验探究非炎症性血清标志物的生物功能非炎症性血清标志物与胃腺癌细胞共培养,绘制细胞生长曲线及抑制率曲线,计算其对细胞的20%抑制浓度(IC20)、50%抑制浓度(IC50)及80%抑制浓度(IC80)。利用EdU,PI-AnnexinV双染法流式凋亡分析,划痕实验,transwell跨膜侵袭实验以及PI法细胞周期分析方法来检测标志物对胃腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、跨膜侵袭及细胞周期分布的影响。胃腺癌与N端标记FITC绿色荧光的非炎症性血清标志物共培养,倒置荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜观察标志物在细胞中的定位。通过实时荧光定量PCR及WB来检测凋亡相关因子,细胞增殖相关因子以及相关信号通路关键因子的mRNA及蛋白的表达水平来探究其作用机制。2.4体内实验探究非炎症性血清标志物的生物功能胃腺癌细胞荷瘤免疫缺陷鼠模型构建成功后,选出瘤体大小相同的小鼠,随机分为四组,每组3只。一组腹腔注射生理盐水为对照组,另外三组腹腔注射梯度浓度的标志物。给药时间间隔为2天/次,持续24天。人工注射非炎症性血清标志物或生理盐水至裸鼠体内的第一天起,每3-4天用游标卡尺测量肿瘤体长径和短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。治疗完成后,根据安乐死相关规则处死小鼠,剥离瘤体,进行称重、拍照,采用TUNEL检测方法分析免疫缺陷小鼠荷瘤模型瘤体组织中细胞凋亡情况,通过免疫组化方法检测凋亡相关因子,细胞增殖相关因子以及相关信号通路关键因子的蛋白的表达水平。结果1胃癌血清中非炎症性标志物的筛选、鉴定、验证及其诊断、预后效能评估通过组间对照及Wilcoxon秩和检验,将探索组中差异性蛋白质峰值筛选出来,结果发现:胃癌术前组与正常对照组血清中筛选出15个差异性蛋白质峰值,其中有9个蛋白质峰值在术前组中高表达,6个蛋白质峰值在正常对照组中高表达;术后组与术前组血清中筛选出13个差异性蛋白质峰值,其中有10个蛋白质峰值在术后组中高表达,3个蛋白质峰值在术前组中高表达;复发组与术后组血清中筛选出15个差异性蛋白质峰值,其中有9个蛋白质峰值在复发组中高表达,6个蛋白质峰值在术后组中高表达;术前组及SIRS组血清中筛选出19个差异性蛋白质峰值,其中有9个蛋白质峰值在术前组中高表达,10个蛋白质峰值在SIRS组中高表达,且始终未见到m/z 6449的蛋白峰,其中m/z 4279.326,4312.117,4968.221,5332.653,5650.360,5919.453 及 8622.667 这 7 个蛋白质峰经后续鉴定为与胃癌关系密切的炎症因子,分别是细胞间粘附分子-1(ICAM-1),白细胞介素-8(IL-8),活性氧物种(ROS),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素1α(IL-1α),肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样蛋白2(TIPE2)及环氧合酶-2(COX-2)。通过遗传学算法结合支持向量机(SVM)的方法筛选出约登指数最高的最佳诊断模型,结果发现对照、术前、术后、复发血清中呈动态变化的m/z6449 Da为最终的候选标志物,且术前组及SIRS组血清中筛选出19个差异性蛋白质峰值中未出现m/z 6449 Da,其中有7个为与胃癌关系密切的炎症因子,故排除了炎症因子潜在的干扰,m/z 6449 Da为非炎症性标志物。与对照组相比,m/z 6449 Da蛋白在术前组高表达,术后组低表达,复发组又表达上调。此外,m/z 6449Da蛋白随着胃癌临床分期增加,表达强度递增。用“留一法”SVM分类器评价模型的预测效果,结果发现:m/z6449Da蛋白能够有效区分鉴别胃癌与对照,准确率为 85.3%(157/184),敏感度为 85.0%(102/120),特异度为 85.9%(55/64)。为验证上述得到的判别模型的准确性和可行性,用测试组进行盲法测验,结果发现:m/z6449Da多肽表达强度在术前组高于对照组,其结果与探索组相一致。用“留一法”SVM分类器评价模型的预测效果,结果发现与探索组一致:m/z6449 Da非炎症蛋白质标记物能够有效区分鉴别胃癌与对照,准确率为84.8%(95/112),敏感度为 86.7%(52/60),特异度为 82.7%(43/52)。根据SELDI-TOF-MS筛选结果,选择m/z6449Da蛋白表达强度高的血清标本作为对象,通过HPLC对其进行分离纯化,用EP管分别收集HPLC不同时间点峰值上对应的蛋白质,然后通过MALDI-TOF-MS寻找质荷比为6449Da的分装蛋白,酶解6449Da的分装蛋白,然后通过MALDI-TOF/TOF MS系统检测酶解的肽段。将收集到的数据导入Mascot检索程序并在Swissprot数据库检索,结果发现m/z 6449 Da为载脂蛋白CⅢ的一个肽段。通过WB及ELISA方法同时验证6449 Da在胃癌血清中的表达情况,结果发现:与对照组相比,m/z 6449 Da蛋白在术前组高表达,术后组低表达,复发组又表达上调,与SELDI-TOF-MS结果相一致。基于ROC曲线及Kaplan-Meier生存分析方法,发现:不管是单独应用还是联合应用来区分鉴别胃腺癌与正常健康人群,m/z6449Da候选蛋白质生物标志物的诊断效能均明显优于传统三种标志物;6449Da候选非炎症蛋白标志物代表了一种新的更强的潜在胃腺癌预后因子。2 6449 Da蛋白多肽性能结构预测及合成ApoC-Ⅲ前体全长99个氨基酸,成熟apoC-Ⅲ由79个氨基酸组成,通过DNAStar,PepCalc,PSIPRED,SWISS-MODEL 等软件对 6449Da 多肽进行信号肽、性能、二级结构及同源建模分析,结果发现:6449 Da多肽C端前20个氨基酸为信号肽;结合抗原指数、表面可及性、亲水性三个指数,发现活性位点主要集中在信号肽以外的40个氨基酸组成的WSGC肽,信号肽几乎不存在活性位点。基于以上预测结果和PeptideSyn技术平台,我们从C端逐个敲除氨基酸并进行多肽合成,然后进行细胞毒性功能试验,结果发现:敲除C-端由20个氨基酸组成的信号肽后剩余的WSGC肽是6449Da的功能片段。3 WSGC肽体外实验结果通过WSGC肽干预胃腺癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞后,绘制细胞生长曲线及细胞毒性抑制率曲线,发现WSGC肽对胃腺癌细胞的毒性作用要比对正常胃粘膜上皮细胞作用强,对胃腺癌细胞细胞毒性作用有相对特异性。随后我们通过CCK-8、EdU、流式细胞仪、划痕实验及transwell跨膜侵袭实验,结果发现:IC50(48h)和IC80(48h)浓度的WSGC肽能抑制胃腺癌细胞增殖,诱导细胞分裂S期的阻滞,提高肿瘤细胞凋亡比例,降低或抑制细胞迁移及跨膜侵袭。此外,FITC绿色荧光标记的WSGC肽与胃腺癌细胞共同培养48h后,通过倒置荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜观察,结果显示WSGC-FITC主要分布于胃腺癌细胞膜表面,很少进入胞质或胞核。QRT-PCR及WB结果显示:与对照组相比,经过IC50(48h)及IC80(48h)剂量的WSGC肽干预胃腺癌细胞48h后,IC50及IC80组胃腺癌细胞中Bax,Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平均高于对照组,而IC50、IC80组胃腺癌细胞中Bcl-2,Ki67,PCNA,NOTCH1,Jagged 1,MAML3,CSL及HES1的mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组。4 WSGC肽体内实验结果通过梯度 WSGC 肽浓度(0nmol/g,20nmol/g,40nmol/g,80nmol/g)干预胃腺癌荷瘤免疫缺陷小鼠模型,发现经过40 nmol/g、80 nmol/g剂量WSGC治疗后,胃腺癌瘤体重量及体积均低于对照组。治疗完成后,根据安乐死相关规则处死小鼠,剥离瘤体,分别进行瘤体组织TUNEL检测凋亡及免疫组化分析,结果显示:随着WSGC肽用药剂量的增加,胃腺癌荷瘤小鼠模型瘤体组织中细胞凋亡率均呈递增趋势;与对照组相比,胃腺癌荷瘤小鼠模型瘤体组织中Bax和Caspase-3蛋白的表达随着WSGC肽剂量的增加而增高,而Bcl-2,Ki67及PCNA蛋白的表达随着WSGC肽剂量的增加而递减。结论● M/z6449Da蛋白多肽是胃腺癌患者血清中特异性非炎症性生物标志物,是传统胃腺癌肿瘤标志物的补充,来源于apoC-III,由60个氨基酸组成,可用于胃腺癌的诊断及预后评估。●敲除C-端20个氨基酸组成的信号肽后由40个氨基酸组成的WSGC肽是6449Da抗肿瘤肽的功能片段,WSGC肽对胃腺癌细胞有促凋亡、抑制增殖作用,诱导细胞S期的阻滞,降低或抑制细胞迁移及跨膜侵袭。● WSGC肽通过notch信号通路发挥生物功能,可能一方面在胃腺癌细胞膜表面通过与Jagged 1配体竞争结合NOTCH1受体,另一方面NOTCH1通过JNK信号通路激活线粒体途径介导的凋亡进程。