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大多数慢性肾脏病(chronickidneydisease，CKD)不可避免最终都进展到终末期肾脏病(endstagerenaldisere，ESRD)。肾小管间质纤维化(tubulointerstitialfibrosis，TIF)是各种原因肾脏疾病进展到终末期肾脏病的共同途径。因此，有关肾小管间质纤维化发生机制及其防治的研究成为目前肾脏疾病的研究热点。
肾小管间质纤维化的特征是肾小管和管周毛细血管消失，肾间质炎症细胞如巨噬细胞和淋巴细胞浸润，肌纤维母细胞(myofibroblast)和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)积聚。目前已有大量证据表明肾小管上皮细胞转分化(tubulaurepithelial-to-mesenchymaltransition，TEMT)在肾间质纤维化中起重要作用。
TEMT是指肾小管上皮细胞失去上皮细胞特性而获得肌成纤维细胞特性。Liu认为TEMT的发生主要有4个关键步骤：①上皮细胞的黏附特性丢失；②表达间充质细胞的标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)以及肌动蛋白重构；③肾小管基底膜断裂；④细胞迁移和侵袭能力增强。
转化生长因子-β(transforminggrowtfrwethfactor-β，TGF-β)能有效诱导肾小管上皮细胞发生EMT，其分子机制主要是通过调控细胞内多种信号分子，如smads、Ras、MEK、p38MAPK、Jagged/Notch、WNT/GSK3/β-catenin、NF-κB和PI-3K等实现。
Numb基因最早在果蝇中发现。早期研究发现Numb在果蝇神经系统发育和肌发生过程中起细胞命运决定(cellfatedetermination)作用。其机制是Numb在细胞分化过程中不对称分布而影响细胞极性，这种作用是通过抑制Nocth信号通路实现的。后续的研究相继在斑马鱼、小鼠、大鼠、鸡、猩猩和人等脊椎动物中分离出Numb基因，证明Numb基因是一个高度保守的基因。
在心脏瓣膜发育和肿瘤的发生中Notch信号的活化可以促进上皮细胞转分化，而Numb在哺乳动物能抑制Notch信号，那么Numb是否通过抑制Notch信号而参与TEMT的发生?
在大脑皮层发生过程中，Numb对维持放射状胶质细胞的黏附连接和细胞极性具有重要作用，而TEMT的始动环节是细胞极性和细胞连接的破坏，那么Numb对细胞极性的影响是否在TEMT过程中起作用?
另有文献报道Numb的磷酸化调控Integrin的内吞作用而引导其定位至细胞侧缘而参与细胞迁移，而上皮细胞迁移能力增强是TEMT的关键步骤之一，那么Numb是否通过影响肾小管上皮细胞的迁移能力而参与TEMT的发生?
基于以上背景，我们设计了如下实验旨在探讨Numb在肾小管上皮细胞转分化及肾间质纤维化中的作用。
一.观察Numb在肾小管间质纤维化中表达的变化。
1.观察Numb在人肾小管间质纤维化病理标本中表达的变化
目的：通过检测肾活检病理标本中Numb在正常的肾小管间质和纤维化的肾小管间质表达的差异，了解在人肾小管间质纤维化过程中Numb的变化。
方法：选取12例肾活检肾病患者，6例病理诊断结果为肾小管间质正常，6例病理诊断提示肾小管间质纤维化。PAS和Masson染色观察肾活检组织肾小管间质病变；免疫组织化学染色检测α-SMA和Numb蛋白在肾小管间质中的表达。
结果：PAS和Masson染色可见正常肾小管间质组肾小管未见萎缩，肾间质无炎症细胞及纤维组织浸润。而肾小管间质纤维化组则见肾小管严重萎缩，肾间质大量炎症细胞和纤维组织浸润。免疫组化结果显示正常肾组织中α-SMA蛋白仅见于小血管，小管间质罕见；而纤维化组肾小管问质可见大量的α-SMA蛋白表达。正常肾组织Numb蛋白主要表达于远端肾小管，近端肾小管仅有少量表达，而且主要分布于细胞基底侧，肾间质和肾血管未见表达；而纤维化组可见肾小管间质大量Numb蛋白表达，仔细观察其在肾小管的分布，可见Numb在细胞胞浆中弥散分布。
2.观察Numb在小鼠肾小管间质纤维化中表达的变化
目的：通过建立小鼠单侧输尿管梗阻模型，观察在小鼠肾小管间质纤维化过程中Numb表达的变化。
方法：24只雄性C57/BL6小鼠，分为假手术组(Sham组，6只，开腹不结扎输尿管)和单侧输尿管梗阻模型组(UUO模型组，18只，开腹后结扎右侧输尿管)。分别于术后第7，14和21天处死小鼠，留取右侧肾组织。肉眼观察肾组织形态；HE、PAS和Masson染色检测肾组织病理：RT-PCR或Real-timePCR检测Numb、α-SMA和CollagenImRNA表达；WesternBlot和免疫组织化学染色检测Numb、E-cadherin、α-SMA和CollagenI蛋白表达。
小结：
(1)本研究首次探讨Numb在肾间质纤维化中的作用；
(2)人肾间质纤维化过程中Numb在肾小管间质的表达增强，在肾小管细胞中分布也发生改变；
(3)成功建立小鼠UUO模型，其病理表现主要为肾小管间质纤维化，而此过程发生了肾小管上皮细胞转分化；
(4)小鼠肾小管间质纤维化过程中Numb在肾小管间质的表达增强，分布也发生改变，这与人肾活检组织标本的结果一致；
(5)Numb可能与肾小管间质纤维化的发生有关。
二.Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中作用的研究。
1.观察Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中表达的变化
目的：通过采用TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)发生EMT，观察Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中表达的变化。
方法：体外培养NRK52E细胞，与重组人TGF-β1共培养，分别观察不同浓度TGF-β1(0、1、5、10、15、20ng/ml)作用48小时与TGF-β110ng/ml作用不同时间(0、12、24、48、72小时)后NRK52E细胞的反应。RT-PCR或Real-timePCR、Westernblot和细胞免疫荧光染色分别检测E-cadherin、α-SMA和NumbmRNA和蛋白表达。
2.Numb下调表达对大鼠肾小管上皮细胞转分化过程的影响
目的：采用RNA干扰介导Numb表达下调，观察对大鼠肾小管上皮细胞转分化过程的影响。
方法：体外培养NRK52E细胞，脂质体转染方法转染NumbsiRNAoligo，一组继续于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，另一组转染后与10ng/ml的TGF-β1共培养48小时，Westernblot检测NRK52E细胞E-cadherin，α-SMA和Numb蛋白表达。
3.Numb过表达对大鼠肾小管上皮细胞转分化过程的影响
目的：采用质粒转染方法诱导Numb不同异构体过表达，观察对大鼠肾小管上皮细胞转分化过程的影响。
方法：体外培养NRK52E细胞，脂质体转染方法分别转染Numb不同异构体p65、p66、p71和p72质粒，继续于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，Westernblot检测NRK52E细胞E-cadherin，α-SMA和Numb蛋白表达。
4. TGF-p诱导大鼠肾小管上皮细胞Numb上调表达分子机制的研究。
目的：通过抑制TGF-β信号通路相关信号蛋白，观察对TGF-β诱导的大鼠肾小管上皮细胞Numb表达的影响，初步探讨TGF-β诱导的大鼠肾小管上皮细胞Numb上调表达的分子机制。
方法：体外培养NRK52E细胞，分别与含Wortmannin(PI-3K抑制剂)、PD98059(MEK抑制剂)、SC68376(p38MAPK抑制剂)、PKAI(蛋白激酶A抑制剂)和Ro-31-8220(蛋白激酶C抑制剂)的培养基共培养40分钟后，一组与TGF-β1共培养，另一组不与TGF-β1共培养。Westernblot检测NRK52E细胞Numb蛋白表达。
结论
Numb可以促进肾小管上皮细胞转分化并在肾小管间质纤维化中发挥作用。