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[目的]为评价三法三穴对SNI大鼠坐骨神经SC增殖和神经瘢痕形成的影响而开展本实验,本实验从行为学、组织形态学与分子生物学三个层面,评价三法三穴干预能否通过调节TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,影响SNI模型大鼠坐骨神经损伤点SC增殖及神经瘢痕的形成,促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。以期进一步揭示推拿促进坐骨神经损伤后修复的机理,完善推拿治疗周围神经损伤的理论基础,为推拿治疗周围神经损伤疾病提供科学证据。[方法]1 动物分组、造模和干预方法选取健康雄性SD大鼠78只,随机分为假手术组、模型组、三法三穴组,每组各26只。采用坐骨神经夹持损伤法制备SNI模型大鼠。三法三穴组从造模后第8天(d)开始,对大鼠殷门穴、承山穴、阳陵泉穴进行点法、拨法、揉法干预,每穴每手法1min。干预10d休息1d,共干预20次。2行为学检测方法每组每个时间点随机选取6只大鼠进行行为学观察。在造模后7d、14d、21d、28d,检测各组大鼠斜板试验角度。在造模后7d、28d,检测各组大鼠SFI。3组织形态学检测方法每组随机选取4只大鼠,在造模后28d时运用HE染色法,观察SNI大鼠坐骨神经损伤点SC细胞数目和神经瘢痕厚度及染色深度的变化。4蛋白定量检测方法每组每个时间点随机选取4只大鼠,运用免疫荧光标记法,观察造模后7d、28d时坐骨神经损伤点中S100、TGF-β1、Smad2及造模后28d时坐骨神经损伤点Ⅰ/Ⅲ型胶原和FN的表达变化。每组每个时间点随机选取6只大鼠,运用Western-blotting技术,检测坐骨神经损伤点在造模后7d、14d、28d三个时间点TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达变化。5统计方法使用Image J 1.48u软件分析免疫荧光和Western-blotting图像。使用SAS 8.0软件对数据进行统计分析。[结果]1三法三穴干预对SNI大鼠运动功能恢复的影响SFI结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,大鼠SFI显著降低(P<0.01)。三法三穴组与模型组相比,大鼠SFI显著升高(P<0.01),且接近假手术组水平。斜板实验结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d、21d、28d,大鼠斜板倾斜角度显著降低(均有P<0.05)。三法三穴组与模型组相比,造模后14d、21d,大鼠斜板倾斜角度有升高趋势(P>0.05),造模后28d,斜板倾斜角度显著升高(P<0.05)。以上结果提示:三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢精细动作及后肢肌力的恢复,说明三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。2三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经SC增殖的影响HE染色结果:假手术组神经纤维轴索及髓鞘完整、排列紧密,SC核嵌于鞘膜外。模型组神经纤维稀疏、散乱,鞘膜外SC核数量较假手术组减少。三法三穴组坐骨神经可见再生的神经纤维,并有很厚的髓鞘包绕、轴索清晰,鞘膜外SC核数量较模型组明显增多。S100免疫荧光染色结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠坐骨神经损伤点SC标记物S100的平均光密度值明显降低(均有P<0.05)。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,坐骨神经S100平均光密度值明显升高(P<0.05)。以上结果提示:三法三穴干预能够增加神经损伤后期SC的数目。3三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经瘢痕形成的影响HE染色结果:造模后28d,假手术组坐骨神经损伤点神经外膜结缔组织深染,模型组神经外膜结缔组织深染,三法三穴组神经外膜结缔组织染色较模型组明显变浅。Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN免疫荧光染色结果:造模后28d,与假手术组相比,模型组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原、FN表达均明显增多(均有P<0.05)。与模型组相比,三法三穴组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN表达均明显减少(均有P<0.05)。以上结果提示:三法三穴干预能够抑制SNI大鼠坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN分泌,从而抑制神经外膜瘢痕形成。4三法三穴干预对TGF-β1/Smad2通路蛋白表达的影响免疫荧光染色结果:TGF-β1表达部位与S100高度重合,且在模型组、三法三穴组坐骨神经外膜也出现高表达,Smad2表达在DAPI表达位置附近。模型组与假手术组相比,造模后7d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量明显升高(P<0.05),造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异(P>0.05)。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异(P>0.05)。模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量明显升高(均有P<0.05),三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量无明显差异(P>0.05)。Western-blotting结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量明显升高(均有P<0.05),造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异(P>0.05)。三法三穴组与模型组相比,造模后14d,坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量出现下调趋势(P>0.05),造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异(P>0.05)。以上结果提示:坐骨神经损伤后,TGF-β1主要在SC和损伤神经外膜中表达,Smad2在细胞核周围表达。三法三穴干预在周围神经损伤早期对TGF-β1/Smad2通路蛋白有轻微的下调作用,可能与神经瘢痕形成有关。[结论]三法三穴干预能够增加损伤后期SNI大鼠坐骨神经SC的数目。三法三穴干预能够通过轻微下调TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,抑制SNI大鼠坐骨神经瘢痕的形成,以促进SNI大鼠运动功能恢复。