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酿酒酵母中的乙酰辅酶A是酯类重要的前体物质,酯类物质作为我国白酒中重要的风味化合物,赋予白酒丰富的香味。本研究主要用于提高酿酒酵母中乙酰辅酶A的水平,并测定乙酸乙酯的含量侧面表征乙酰辅酶A的变化。主要通过研究敲除ACH1(编码乙酸:琥珀酰CoA转移酶基因),过表达PDH旁路途径上的ALD6(编码乙醛脱氢酶基因)和ACS1/2(编码乙酰辅酶A合成酶基因)对乙酰辅酶A的影响。主要研究内容及结论如下:(1)用长引物法敲除ACH1基因,获得敲除菌株a5ΔACHI。在摇床条件下和发酵条件下,敲除ACH1基因后,相对于α5,乙酰辅酶A的含量分别提高了33.24%和17.70%,在玉米糖化醪发酵条件下,乙酸乙酯的含量没有太大变化。(2)构建过表达ALD6基因的过表达质粒Yep-PAK6,用长引物法将Yep-PAK6 质粒上扩增的重组片段 AA-PGK1P-ALD6-PGK1T-KanMX-AB 转入 α5中,得到过表达菌株α5-ALD6。在摇床条件下和发酵条件下,乙酰辅酶A的含量相对于α5分别提高了 41.59%和24.62%,而在玉米糖化醪发酵条件下,相对于α5,乙酸乙酯的含量降低了 21.26%,同时正丙醇降低了 33.91%,10.53%和23.88%。(3)主要研究ACS1及ACS2基因对乙酰辅酶A的影响。首先,构建单独过表达ACS1及ACS2基因的菌株α5-ACS1和α5-ACS2。在摇床条件及发酵条件下,均为α5-ACS1产生的乙酰辅酶A的含量较高,较α5分别提高了 44.34%和56.34%,而α5-ACS2产生乙酰辅酶A的含量较α5分别提高了 42.60%和30.94%,相应地,乙酸乙酯的含量较α5分别提高了 15%和10.34%。其次,在过表达ACS1和ACS2基因的基础上,过表达醇乙酰基转移酶基因ATFI,得到菌株Al-ATFl和A2-ATF1,其产生的乙酸乙酯的含量分别是对照菌株α5-ATFl的2.04倍和1.25倍。最后,对ACS1基因定点突变,得到游离和整合共表达菌株AY-ACSlL707p和α5-ACS1L707p,乙酰辅酶A的含量较原菌AY15和α5分别提高了 32.35%和1.04倍,乙酸乙酯含量较原菌AY15和α5分别提高了 7.60%和20.25%。(4)构建共表达ALD6和ACS1L707p游离质粒Yep-ABLS,导入双倍体AY15中,得到游离共表达菌株AY-1,相对于AY15,其乙酰辅酶A的含量提高了63.70%,乙酸的含量降低了 14.67%,乙酸乙酯的含量提高了 10.26%;再将共表达片段转入单倍体α5中,得到整合共表达菌株α5-1,相对于α5,其乙酰辅酶A的含量提高了 1.5倍,乙酸的含量提高1.96倍,乙酸乙酯的含量降低了 28.24%。