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植物叶片的衰老是普遍发生的自然现象,它不是叶片细胞的简单死亡,而是一种动态的细胞程序性死亡过程,衰老产生的氮素等营养物质被运至幼嫩的叶片、发育中的种子和储藏器官中加以利用或储存。除了内在因素的调控和影响,叶片的衰老也受环境因素的影响,如干旱,水涝,高或低太阳辐射,极端温度,臭氧和其他空气污染物,土壤盐分过高,还有土壤中矿质营养不足。通过调控植物体内的细胞分裂素水平,可以延缓叶片衰老,并能提高植物的抗生物和非生物逆境胁迫能力。
本实验中克隆了来源于棉花的半胱氨酸蛋白酶(Ghcysp)启动子,并将其与编码细胞分裂素生物合成途径的限速酶-异戊烯基转移酶基因(IPT)构建嵌合基因导入早衰型陆地棉品种中棉所10号,获得的纯合转PGHCP::IPT基因植株不仅具有延迟叶片衰老的特性,提高了棉花的产量,改善了纤维品质,还具有良好的耐盐性,从而为抗衰老、耐盐转基因棉花研究提供了优异的种质材料。实验获得的主要结果如下:
1.根据Ghcysp编码区的上游序列,设计专一引物,利用接头PCR技术,从早衰型陆地棉品种辽棉所9号中分离得到长度为1045bp的棉花半胱氨酸蛋白酶(Ghcysp)启动子序列(GenBank号为GQ919043)。利用在线植物作用启动子分析软件PLACE与PlantCARE,分析确定了Ghcysp启动子序列中存在着多个细胞分裂素和逆境胁迫调控的顺式元件,这说明Ghcysp启动子可以由细胞分裂素和逆境诱导调控。
2.利用花粉管通道技术,将构建的含有PGHCP::IPT嵌合基因的植物表达载体pBGI导入早衰型陆地棉品种中棉所10号,经PCR和Southern blot检验分析表明,外源DNA片段已成功地整合到受体中棉所10号基因组中。经过卡那霉素筛选、后代与其父母回交、分离鉴定得到了3个纯合的单拷贝转PGHCP::IPT棉花株系S1,S2,S3。
3.纯合转PGHCP::IPT基因棉花后代植株与非转基因植株生长形态特征一致,生育期相同。通过对展开天数不同的叶片衰老进程生理生化指标和外源基因表达分析,结果表明:衰老特异性启动子(Ghcysp启动子)启动了IPT基因的表达,纯合转PGHCP::IPT基因棉花后代植株显著或极显著提高了叶片叶绿素含量,细胞分裂素含量水平和清除活性氧的抗氧化酶活性,叶片衰老得到明显的延迟。纯合转PGHCP::IPT基因棉花后代植株较非转基因植株叶片衰老延迟15天左右。
4.转PGHCP::IPT基因棉花后代的田间农艺性状调查结果表明,纯合转PGHCP::IPT株系S1,S2,S3籽棉产量比相对应的非转基因植株分别增产25.4%,23.8%和26.1%。转基因株系的皮棉产量极显著高于非转基因株系的产量,与非转基因植株相比,转基因材料的棉纤维一致性、纤维强度提高,纤维长度更长。结果表明,纯合PGHCP::IPT植株后代不仅延缓了植株的衰老,并且提高了棉花的产量,改善了纤维品质。
5.棉花苗期(五叶期)经200 mM NaCl处理1天,7天,14天,21天后,纯合转PGHCP::IPT基因棉花后代植株的干重,IPT基因表达水平,内源细胞分裂素的含量水平均高于非转基因植株。耐盐性实验结果表明,转PGHCP::IPT植株较非转基因植株能够有效的抑制盐诱导引起植株的衰老。
6.转PGHCP::IPT棉花植株的抗早衰及耐盐性分析综合评定,转PGHCP::IPT棉花植株不仅具有延缓衰老的特性,而且可以减少对盐胁迫的敏感性,具有较强的耐盐能力。从而为抗衰老、耐盐转基因棉花育种提供了优异的种质材料。