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西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的重要成员,其基因组为约11Kb的单股正链RNA分子,包含一个单一读码框,分别编码3个结构蛋白(C, prM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。人类感染西尼罗病毒后可发展成无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹等严重的神经系统感染性疾病。自1937年首次从乌干达西尼罗地区的一名发热病人分离到西尼罗病毒以来,西尼罗病毒已先后在非洲、欧洲、亚洲、中东、北美等地区引起流行。目前尚缺乏针对人类西尼罗病毒感染的有效治疗方法和疫苗。西尼罗病毒包膜蛋白(Envelope protein, E Protein)的功能区由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(domain I, domainⅡ, domainⅢ, DI, DⅡ, DⅢ)三个结构域构成。DⅢ区由7个条带状折叠构成,呈免疫球蛋白样,在介导病毒-细胞受体吸附中发挥重要作用。DⅢ区E307, E330, E332等抗原表位,可以诱导有效中和抗体产生。本实验诣在评估西尼罗病毒E蛋白DⅢ区对病毒感染的影响和E蛋白DⅢ区免疫小鼠后所产生中和抗体的免疫保护作用,阐明西尼罗病毒E蛋白DIII区的功能,为国内西尼罗病毒亚单位疫苗的开发奠定基础。研究内容主要包括以下三个部分。一、西尼罗病毒E蛋白DⅢ区的原核表达和其抗原性鉴定本研究采用RT-PCR的方法从西尼罗病毒AY490240株中扩增E蛋白DIII区基因。将目的基因同pET32a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白表达后利用Ni-NTA亲和层析株进行纯化。纯化后的西尼罗病毒E蛋白DⅢ区融合蛋白经Western blotting证实有较好的抗原性,为西尼罗病毒E蛋白DIII区的功能研究奠定了基础。二、西尼罗病毒E蛋白DⅢ区对西尼罗病毒感染的影响原核表达的西尼罗病毒E蛋白DⅢ区融合蛋白经重组肠激酶酶切去除Trx-His-S-tag标签蛋白。用噬斑减少实验检测西尼罗病毒E蛋白DIII区在西尼罗病毒感染BHK-21细胞过程中的影响。实验表明西尼罗病毒E蛋白DIII区能明显抑制西尼罗病毒对BHK-21细胞的感染。这可能与西尼罗病毒E蛋白DIII区对西尼罗病毒的竞争性抑制有关。三、西尼罗病毒E蛋白DⅢ区对西尼罗病毒感染小鼠的免疫保护作用采用皮下多点注射方式免疫Balb/c小鼠。使用DⅢ区融合蛋白和弗氏佐剂的乳化液免疫小鼠,每只小鼠每次注射25μg融合蛋白。免疫间隔期为2周,总共免疫3次。用间接免疫荧光测定免疫后小鼠血清中的抗体效价,用蚀斑减少中和实验测定抗体的中和效价。第2次加强免疫后2周,使用西尼罗病毒攻击免疫后小鼠,了解西尼罗病毒E蛋白DIII区能否对免疫后小鼠产生保护作用;免疫后小鼠血清的抗体效价可达1:2560,中和抗体效价为1:160,表明西尼罗病毒E蛋白DIII区免疫小鼠可诱导特异性中和抗体的产生。与对照组相比,西尼罗病毒E蛋白DIII区能使80%免疫后小鼠免受病毒的致死性感染,具有较好的免疫保护作用。本研究表明,西尼罗病毒E蛋白DIII区在病毒感染过程中发挥重要作用,能刺激小鼠产生特异性的体液免疫应答反应,具有较好保护作用,为研发高效价的病毒亚单位疫苗奠定了基础。