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蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）是一种杆状革兰氏阴性细菌,为肠杆菌科哈夫尼亚菌属的代表性细菌。因其具有嗜冷、喜好厌氧潮湿环境等特点,常常成为低温贮藏食品中的特定腐败菌（Specific Spoilage Organisms,SSO）。研究表明,其致腐行为受由N-酰基-高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）介导的lux型群体感应系统的调控。因此,本文以腐败大菱鲆中分离纯化得到的一株蜂房哈夫尼亚菌Ha-01为研究对象,通过基因工程和生物信息学等技术研究其菌株内的lux型群体感应调控基因halI/R,初步探究二者编码的HalI/R蛋白的功能性质,并讨论二者能否对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的形成起到调控作用。研究旨在探讨由群体感应系统调节的鱼类腐败机制,为建立以靶向控制群体感应系统为基础的水产品保鲜新技术提供理论依据。1.根据GenBank中登录halI/R基因序列设计特异性扩增全长引物,利用TA克隆技术构建克隆载体pMD-halI和pMD-halR,并导入宿主E.coli JM109中大量扩增;后经测序及BLAST比对分析,结果显示由蜂房哈夫尼亚菌Ha-01中克隆、测序获取的基因片段序列与已登录的halI/R基因序列相似度分别达100%和99%,这表明大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌Ha-01中确实存在群体感应基因halI及halR。2.从halI/R基因编码的氨基酸序列出发,预测了HalI/R蛋白的基本性质,其中HalI大小为25.06 KDa、理论等电点为5.46,HalR大小为27.97KDa、理论等电点为6.98;疏水性分析表明二者均为亲水性蛋白;不含有信号肽和跨膜区表明二者均为非分泌蛋白,可能在胞内有可溶性表达;功能区预测显示二者分别具有自诱导物合成酶特征结构、LuxR型蛋白的HTH特征结构;二级结构和立体结构预测结果表明它们具有明显的构象差异,且预测的三维模型质量良好可用于后续分子对接研究;蛋白交互作用结果表明二者可构成一套群体感应系统,并对细菌生物膜的产生具有调控作用。另一方面,从halI/R基因的核酸序列出发对它们的密码子使用偏向性进行了分析,结果表明二者宜用大肠杆菌表达系统进行表达。3.将目的基因进行密码子优化以提高理论表达效率;利用In-fusion克隆技术成功构建出重组表达质粒pET22-halI和pET28-halR,转化至宿主菌E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,诱导条件为37℃,1mM IPTG诱导4 h;SDS-PAGE和Western Blotting结果表明,二者均能在大肠杆菌宿主BL21（DE3）内实现高效表达,且部分为胞内可溶性表达。4.生物感应器菌株CV026产色实验和GC-MS分析结果表明HalI蛋白能够合成AHLs类信号分子C6-HSL,其在蜂房哈夫尼亚菌QS系统中起自诱导物合成酶的功能;体外结合实验和分子对接结果表明HalR蛋白主要以氢键作用结合C6-HSL,其在蜂房哈夫尼亚菌QS系统中起受体蛋白的功能;此外,生物膜的相关结果表明,二者构成的HalI/R群体感应系统对蜂房哈夫尼亚菌Ha-01生物膜的形成具有明显的调控作用。