应答丙型肝炎病毒(HCV)侵染的人源活细胞实时报告系统的构建以及其在病毒侵染机制研究中的应用初探

• 作 者: 李婵
• 机 构: 北京大学
• 出 处: 北京大学
• 发表日期: 2013年期
• 关键词: 丙型肝炎病毒 NS3/4A复合体 TALENs技术 基因敲除 双信号报告系统 病毒侵染机制

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是引起人类病毒性肝炎的主要病原之一。全世界共有约1.7亿慢性丙型肝炎患者，并且每年有成百上千的病人死于由慢性丙肝导致的肝硬化或者肝癌。针对HCV的侵染现在并没有疫苗或者十分有效的药物。为了研究HCV的侵染机制，在过去的几年里，研究者们成功地实现了在体外培养细胞系里完成HCV的整个生命周期并获得具有感染性的病毒颗粒。尽管目前已经有许多研究HCV的系统，但是仍然缺乏一个灵敏、便于定量检测并且能够适用于大规模遗传文库筛选或者小分子化合物文库筛选的体外系统。　　在本研究中，通过改造HCV非结构蛋白NS3/4A的宿主底物，在宿主细胞里构建了能对HCV侵染产生应答的荧光系统和“自杀”两套报告系统。本研究证明了该系统能够且仅对HCV的侵染做出特异应答，并且可以对其信号强度进行定量检测。在原有的系统的基础上，还进行了升级改造，将荧光和“自杀”的信号合并为一，构建了双信号报告系统。该系统的监测灵敏度有大幅度提升，而且能够在实验中根据不同的需要使用不同的信号并且互为验证支持。利用这一报告系统，在宿主细胞中进行了全基因组shRNAmir遗传文库筛选，获得了在HCV侵染过程中可能起重要作用的候选宿主蛋白。　　同时，本研究成功地将报告系统应用到之前难以研究解决的领域，特别是病毒侵染的入胞机制以及HCV在细胞与细胞之间的传播与扩散(Cell-cell transmission)。结合TALEN技术介导的基因敲除技术，在报告系统上对HCV入胞过程相关的蛋白进行了广泛的研究。本研究清楚地证明之前报道过的Claudin1蛋白在HCV入胞以及细胞间的传递过程中均起到不可或缺的作用;而之前报道的膜表面蛋白Occludin在病毒入胞过程中起必要作用，但是并不参与病毒在细胞之间的传递机制。这一以宿主为基础的报告系统，不仅在灵敏度、可靠性、专一性方面优于已经报道的任一系统，而且优于直接标记HCV的荧光报告系统，因为后一系统很难研究HCV在细胞间的传递机制。　　此外，本研究还针对HCV的非结构蛋白NS3/4A复合体，利用蛋白质组学和质谱的技术筛选获得了新的宿主底物和可能的新药物靶位点。这些底物在病毒侵染以及HCV导致的肝细胞硬化甚至肝癌发生的可能作用有待进一步研究。