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西瓜（Citrullus lanatus）是世界范围内广泛种植的重要园艺作物,在早春露地栽培以及反季节设施栽培中常常遭遇低温胁迫。研究西瓜在低温胁迫下的基因表达模式,鉴定差异表达基因的功能,有助于进一步了解西瓜低温响应及调控机制,为西瓜耐低温遗传改良提供理论支撑和基因资源。WRKY转录因子家族成员数量多且具有重要功能,不仅影响植物生长发育过程,还能够对植物面临的各种胁迫产生响应并发挥调控作用。低温胁迫下的西瓜转录组数据分析结果显示,多个WRKY家族基因的表达模式发生了显著改变,表明WRKY能够响应低温胁迫,但这些基因是否具有调控西瓜耐低温的功能,目前尚不清楚。针对这一问题,本研究在分析西瓜WRKY基因家族特征的基础上,鉴定了2个受低温胁迫诱导显著上调表达的WRKY基因Cla018059和Cla021170的功能,获得了以下研究结果:1.西瓜WRKY转录因子家族鉴定和特征分析。利用隐马尔可夫模型,在西瓜基因组上鉴定出57个WRKY转录因子家族成员,根据家族成员在染色体上的位置,依次命名为ClWRKY1ClWRKY57。蛋白序列比对及系统发生分析表明,57个ClWRKY转录因子中,55个具有保守的7肽WRKYGQK DNA结合结构域,另外2个的WRKY结构域分别为WRKYGKK和KSRKRQV;所有ClWRKY转录因子的锌指结构为C2H2或C2HC类型。根据结构域的数量和锌指结构的类型,ClWRKY家族被分为I、II和III族,各有11、39和7个成员。根据蛋白序列的保守性和进化关系,II族可进一步分为IIa、IIb、IIc、IId和IIe族。基因结构分析表明,ClWRKY基因序列长度在0.7 kb7 kb之间,主要集中在1 kb3 kb。ClWRKY家族成员的外显子含量为26个。共线性分析表明,ClWRKY转录因子家族基因中发生了18组复制事件,其中3组是转座复制,15组是片段复制,片段复制是ClWRKY家族基因扩增的主要模式。复制基因的Ka/Ks值均小于1,发生复制的ClWRKY家族基因在进化过程中受到纯化选择。2.西瓜ClWRKY转录因子家族基因的表达谱分析。西瓜果实发育转录组数据分析表明,除ClWRKY1外,其余56个ClWRKY基因在果实中均有表达,其中50个在果肉中表达,52个在果皮中表达,54个在种子中表达。低温胁迫处理的西瓜转录组数据分析表明,19个ClWRKY基因受低温胁迫诱导呈现显著差异表达,其中7个下调表达,12个上调表达。显著上调表达的基因中,Cla018059（ClWRKY55）和Cla021170（ClWRKY20）的log2FC值最大,表明其对低温胁迫更敏感。因此本课题对这2个基因进行了进一步的研究。3.低温相关西瓜ClWRKY基因的功能鉴定。构建了亚细胞定位表达载体pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY20和pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY55并注射到烟草表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜发现ClWRKY20和ClWRKY55均定位于细胞核。构建了ClWRKY20和ClWRKY55的T1代超表达烟草植株OE20和OE55。对转基因植株进行4℃低温处理,通过对表型、冷害指数、相对电导率及丙二醛含量等指标的分析发现,超表达ClWRKY20基因提高了烟草植株的低温耐受性,而超表达ClWRKY55基因增强了烟草植株对低温的敏感性。抗氧化酶系统活性的检测表明,低温胁迫处理后的OE20植株具有更高的SOD、POD和CAT活性,表明ClWRKY20可能是通过提高植株的抗氧化能力来提高低温耐受性。OE55植株的SOD、POD和CAT活性均低于野生型植株,表明ClWRKY55可能通过削弱抗氧化能力来降低植株的低温耐受性。