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背景与目的：
短串联重复序列STR(short tandem repeats,STR)又称为简单重复序列,属于基因组中的微卫星DNA:其重复单位长度通常为1-6bp,重复次数大致从几次到数十次不等。STR基因座在人类基因组中广泛存在,具有较高的长度多态性。STR基因座作为第二代遗传标记,被广泛应用于人类和医学遗传学、人类进化和法医遗传学等诸多领域。
先天性夜盲症可分为两类:即先天性静止性夜盲症(congenital stationarynight blindness,CSNB)和先天性进行性夜盲症(congenital progressive nightblindness,CPNB)。先天性静止性夜盲症CSNB是一类主要损害视杆系统的遗传性视网膜疾病,其临床特点为患者出生后即出现非进行性夜盲,白天视力和视野一般正常,无眼底疾患且病况终生不变。CSNB遗传方式符合孟德尔遗传规律,最常见的为常染色体显性遗传方式(autosomal dominant congenital stationarynight blindness,ADCSNB)。目前国内外报道的引起ADCSNB的受累基因主要有3个,即视紫红质(rhodopsin,RHO)基因;磷酸二酯酶β亚单位(phosphodiesteraseβ subunit,PDE6B)基因;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α转导活性肽1(guanine nucleotide binding protein,α transducing activity polypeptidel,GNAT1)基因。但是ADCSNB的发病机制还不完全清楚,因此通过分析ADCSNB发生的致病突变,对从分子角度揭示先天性夜盲症的发病机制有其重要的意义;同时为遗传学研究中发展分子诊断、分子治疗以及产前诊断打下基础。
方法：
1.在GenBank上下载RHO、PDE6B、GNAT1这3个基因的DNA序列,用TandemRepeats Finder在线软件在这3个基因附近查找N6个STR基因座,重复单位为四个核苷酸的重复,用Primer3软件在每个基因座两侧设计PCR引物。
2.对PCR反应条件进行优化,在100例正常人群中分析这6个STR基因座的群体遗传学参数和法医学参数,评价其应用价值。
3.利用6个STR基因座分别对该ADCSNB家系进行连锁分析,推断出受累基因。
4.对受累基因进行测序,确定致病突变。
结果：
1.在RHO、PDE6B、GNAT1这3个基因附近共找N6个STR基因座,重复序列均为四核苷酸重复:即RHO(D3R1、D3R2),其重复单位分别为[CAAA]、[TCCC],扩增片段大小为240bp、186bp;PDE6B(D4P1、D4P2),其重复单位分别为[CCTC]、[TGTT],扩增片段大小为157bp、186bp;GNAT1(D3G1、D3G2),其重复单位分别为[TTTA]、[TTCC],扩增片段大小为157bp、171bp。
2.这6个STR基因座在100例河南汉族无关个体分别检出5、3、5、4、4、5个等位基因;分别检出14、6、12、9、10、13个基因型,基因座的多态信息含量(PIC)分别为0.730、0.550、0.670、0.670、0.670、0.710;个体识别率(DP)分别为0.889、0.761、0.850、0.860、0.871、0.891。经x2检验在群体遗传学中均符合Hardy-Weinberg平衡定律。
3.连锁分析表明,该家系患者均带有D3R1的等位基因3,D3R2的等位基因2;因此推断RHO基因为该家系ADCSNB的致病基因。
4.该家系患者RHO全外显子测序,在RHO基因中发现一个c.281C＞T的杂合错义点突变;分析氨基酸序列,发现导致Thr＞Ile的氨基酸改变。
结论：
1.D3R1、D3R2、D4P1、D4P2、D3G1、D3G2基因座是一组良好的遗传标记,有利于对先天性夜盲症进行致病基因定位,为产前诊断奠定基础:这6个STR基因座具有较高的多态性,可用来进行人类和医学遗传学研究;同时D3R1、D4P2、D3G2在法医学的个体识别和亲权鉴定中具有一定的应用价值。
2.c.281C＞T错义突变在蛋白质水平导致p.Thr94Ile的改变,而在家系正常成员以及50例家系外正常成员中均未发现此突变。本研究发现的RHO基因的Thr94Ile突变,为国内首次报道。