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目的:以大鼠神经母细胞瘤细胞(B35)OGD(Oxygen-Glucose Deprivation Model)模型为基础,通过采用血清药理学方法,观察经方补阳还五汤含药血清对OGD损伤所致细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响,探讨补阳还五汤对缺血性脑卒中后脑组织缺血缺氧损伤所致细胞凋亡的保护作用机制,为临床应用补阳还五汤治疗缺血性脑卒中提供科学的理论依据。方法:1.B35细胞氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型的构建。利用氯化钴模拟缺氧环境(氯化钴浓度分别为0.7mmol/ml、0.8mmol/ml0.9mmol/ml、1.0mmol/ml)及1/2含糖培养基模拟缺糖环境联合处理B35细胞12h,以CCK-8检测细胞存活率,以便选取合适的氯化钴造模浓度。2.结合第一步选定的氯化钴浓度制作OGD模型(氯化钴造模浓度为0.8mmol/ml,以DMEM-F12和无糖DMEM制作1/2含糖培养基)。通过流式细胞术对OGD的细胞进行凋亡率分析,通过透射电镜对OGD后细胞凋亡情况及凋亡细胞形态进行分析,初步评价模型是否构建成功。3.检测补阳还五汤含药血清处理后对B35细胞存活率和凋亡率的影响。分别以低剂量的补阳还五汤含药血清(10%)和高剂量的补阳还五汤含药血清(15%)处理OGD组细胞,通过CCK-8和流式细胞术对补阳还五汤含药血清处理过后的细胞进行细胞存活率和细胞凋亡率的分析,评价补阳还五汤含药血清对B35细胞存活率和凋亡率的影响。4、通过Western blot检测补阳还五汤含药血清处理前后,细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3的变化。评价补阳还五汤含药血清处理对细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3的调节作用。结果:1、随着氯化钴浓度的增加,细胞的存活率呈现逐渐下降的趋势,氯化钴浓度0.6mmol/ml、0.7mmol/ml、0.8mmol/ml、0.9mmol/ml的细胞存活率分别为(85.38±2.1)%、(78.25±2.0)%、(50.24±2.1)%、(46±2.2)%;选取氯化钴浓度0.8mmol/ml进行OGD造模,经流式细胞术及透射电镜检测,与空白对照组相比,该浓度可明显诱导细胞凋亡,差异具有统计学意义。2、空白对照组、OGD组、补阳还五汤含药血清低剂量组、补阳还五汤含药血清高剂量组细胞存活率分别为(95.09±0.73)%、(49.77±2.52)%、(60.00±2.65)%、(64.85±1.44)%。与空白对照组相比,OGD组细胞存活率显著降低,差异具有显著性(P<0.05);与模型组相比,BYHWD含药血清低剂量组和高剂量组细胞存活率升高,差异具有显著性(P<0.05)。BYHWD含药血清高剂量组与低剂量组在改善细胞存活率上具有显著性差异(P<0.05)。与OGD组相比,BYHWD含药血清高、低剂量组可降低细胞凋亡率,p<0.01,差异具有统计学意义;BYHWD含药血清高、低剂量组在降低细胞凋亡率上具有差异性,P<0.05,差异具有统计学意义3、与空白对照组相比,模型组caspase-3、bax蛋白表达量显著升高(P<0.01),bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.01);与模型组相比,补阳还五汤含药血清低剂量组caspase-3表达量降低(P<0.05),bax表达量无显著性差异,bcl-2表达量升高(P<0.05);与模型组相比,补阳还五汤含药血清高剂量组caspase-3、bax表达量降低(P<0.01),bcl-2表达量升高(P<0.05);补阳还五汤含药血清高剂量组与低剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:1.利用氯化钴(浓度0.8mmol/ml)模拟缺氧环境及1/2含糖培养基模拟缺糖环境联合处理B35细胞12h能够诱导正常B35细胞的发生凋亡,并成功制作B35细胞OGD模型。2.补阳还五汤含药血清处理凋亡细胞可以减少细胞凋亡率,增加细胞存活率。3.OGD处理使B35细胞促凋亡蛋白caspase-3、bax的表达增加,使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少;而补阳还五汤含药血清高剂量处理细胞可以降低caspase-3、bax蛋白的表达,増加Bcl-2蛋白的表达,从而抑制神经细胞调亡,发挥神经保护作用,这可能是补阳还五汤减少神经细胞凋亡,治疗缺血性脑卒中的机制之一。综上所述,利用氯化钴模拟缺氧环境及1/2含糖培养基模拟缺糖环境联合处理B35大鼠神经母细胞瘤细胞12h可以显著诱导细胞凋亡,降低细胞存活率,建立细胞OGD模型;且OGD处理可以使细胞促凋亡蛋白caspase-3、bax的表达增加,使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少,Bcl-2/bax比率增加,这是神经元细胞凋亡的机制之一。在予以高剂量的补阳还五汤含药血清(15%)处理细胞后,使促凋亡蛋白caspase-3、bax蛋白的表达降低,使抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达增加,Bcl-2/bax比率上升,从而抑制细胞凋亡,提高细胞存活率,发挥神经保护作用。这可能是补阳还五汤治疗缺血性脑卒中的机制之一。