红松松子壳多糖超声提取工艺的建立与抗肿瘤活性的研究

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多糖(polysaccharide)是广泛存在于生物体内的重要大分子物质。近年来,对于多糖生物学活性的研究主要集中在免疫调节、抗菌、抗病毒、抗凝血、抗氧化与抗肿瘤等方面。红松(Pinus koraiensis)是中国东北地区重要的经济型林木,红松松子壳在东北林区资源丰富,建立红松松子壳多糖的提取工艺可以深化对我国东北地区林副产品的开发与利用。本实验室早期研究发现红松松子壳多糖(Pinuskoraiensis Pinon Shell Polysaccharides, PPSP)具有抗病毒、抗氧化、体外调节免疫细胞活力的生物学功能。本实验旨在建立PPSP超声提取工艺,检测PPSP体外、体内抗肿瘤活性,并基于小鼠肿瘤模型研究PPSP体内对肿瘤细胞的免疫调节作用。通过单因素实验与正交试验优化建立PPSP超声提取工艺,并利用离子交换层析技术对所得的PPSP进行分离纯化,通过物理、化学方法对PPSP、PPSP1、PPSP2进行检测。实验结果表明:最优提取条件为提取温度:85℃,浸提时间:45min,浸提次数:2次,固液比:1:6,该条件下所得多糖的含量为54.41%(P <0.001);经离子交换层析从PPSP中分离得到两种酸性多糖成分,分别命名为PPSP1、PPSP2;物理、化学方法检测PPSP、PPSP1、PPSP2的结果表明以上3种成分主要为多糖成分。设人胚肾细胞293T细胞为对照细胞,利用MTT法对PPSP1、PPSP2体外抗肿瘤(人宫颈癌细胞Hela细胞、人肝癌细胞HepG2细胞、人结肠癌细胞SW1116细胞)活性进行检测;建立H22小鼠实体瘤模型,检测PPSP对动物体重的影响以及其体内抗肿瘤活性。结果表明:各个浓度的PPSP1、PPSP2均可抑制肿瘤细胞的增殖(P<0.001),且抑制率随着多糖浓度、作用时间的增加而增大,其中PPSP2对SW1116细胞的抑制率最高,作用时间60h、多糖浓度800mg/L时抑制率达95.88%,对于对照细胞293T细胞,其增殖在低浓度(100mg/L、200mg/L)的PPSP1、PPSP2作用下被促进,在高浓度的PPSP1、PPSP2作用下被抑制(P <0.001);实验建立了小鼠H22实体瘤模型,通过灌胃给药发现PPSP可以抑制小鼠H22实体瘤的生长,PPSP高剂量组(200mg/kg/d)的肿瘤抑制率达75.63%(P<0.001),且PPSP在正常生理条件下对小鼠的体重无显著影响(P﹥0.05),但PPSP可以延缓荷瘤小鼠的体重减轻(P<0.001)。利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)方法对PPSP对荷瘤小鼠的脾脏、胸腺、血清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ蛋白水平的影响进行检测。结果表明:PPSP可促进荷瘤小鼠脾脏、胸腺、血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ的分泌,PPSP高剂量组荷瘤小鼠的IL-2、TNF-α、IFN-γ蛋白水平最高。本研究表明,超声辅助提取PPSP的最佳提取工艺为:提取温度85℃,浸提时间45min,浸提次数2次,固液比1:6;PPSP具有体外抑制肿瘤细胞增殖的活性,且PPSP体内可抑制小鼠实体瘤的增长,相对于化疗药物组,小鼠体重减轻较少;PPSP对小鼠肿瘤细胞具有免疫调节作用。
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