【摘 要】
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由心动过速及长程起搏引发的心功能异常甚至死亡事件在临床上并不少见,但是它们各自在细胞水平的改变和如何导致这些心功能紊乱的机制仍然知之甚少。本研究通过对人诱导多能
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由心动过速及长程起搏引发的心功能异常甚至死亡事件在临床上并不少见,但是它们各自在细胞水平的改变和如何导致这些心功能紊乱的机制仍然知之甚少。本研究通过对人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)分别实施快速电刺激和长程电刺激来模拟临床心动过速和长程起搏。其中快速电刺激频率为3Hz,时间为7天。设置8h/24h和24h/24h两个亚组分别代表短期和长期心动过速,同时设置频率为1Hz,时间为7天,刺激时间为24h/24h作为阴性对照组。长程电刺激组刺激频率为1.2Hz,时间为2周,并设置起搏百分比为40%和100%的两个亚组。两种电刺激均以未经刺激处理的hiPSC-CMs作为对照组。刺激结束后,通过对刺激后心肌细胞进行免疫荧光染色和透射电镜来观察细胞结构,通过Hoechst染色和AV/PI流式分析来评估细胞凋亡,通过膜片钳技术分析细胞电生理特点,通过JC-1染色检测线粒体功能状态,通过Western Blot和qPCR明确基因表达。与对照组相比,接受快速电刺激的心肌细胞表现出明显的线粒体功能受损;凋亡比例增加,钙瞬变及钙电流幅度明显减小。凋亡基因Caspase3和促凋亡基因BAX表达增多,抑制凋亡基因BCL表达减少。与细胞内钙回收相关的基因表达减少,而磷酸化状态的钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)明显被激活。对照组和慢刺激阴性对照组在上述各方面无显著性差异。快速电刺激同时,用1μM的CaMKⅡ抑制剂KN93可以部分逆转快速电刺激的副作用。与对照组相比,长程起搏刺激后心肌细胞凋亡比例明显增加,细胞收缩相关蛋白cTnT的表达明显减少,动作电位缩短,离子电流密度减小,内质网应激和Calpain活性增强,而且这些改变呈现出起搏百分比依赖性。用Calpeptin抑制Calpain活性可以缓解长程起搏引发的上述不良反应。在本研究中,我们发现快速电刺激扰乱了钙稳态并激活线粒体凋亡途径,从而导致心肌细胞丢失和收缩功能不全。同时快频率电刺激后磷酸化CaMKⅡ水平明显上调,抑制CaMKⅡ能部分逆转快速电刺激带来的不良反应。长程电刺激对心肌细胞的结构特点和电生理特点均产生不良反应,刺激后内质网应激和下游Calpain活性增强,通过抑制Calpain能够部分纠正长程电刺激带来的不良反应。CaMKⅡ和Calpain可能成为临床心律失常病人治疗的新靶点。
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