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随着石油资源的大量消耗及不可再生资源价格的节节攀升,发展环境友好的生物基化学品的生物炼制技术已民成为转变经济增长方式,保障生态链良性循环,实现经济社会可持续发展的战略需求。系统代谢工程由于可以实现微生物的定向改造,如定向增强目标化合物的代谢流量、阻断非目标化合物的生成、调控胞内还原力平衡、扩大菌株的底物利用范围等,已成为实现生物炼制的实际应用的重要手段。2,3-丁二醇是生物炼制体系中一种重要的平台化合物,乙偶姻及双乙酰是2,3-丁二醇合成过程中的前体物质。其中乙偶姻除可作为食品添加剂、烟草添加剂外,因其分子中含有“羟基”及“酮基”两个功能基团,可作为前体物质生成众多化学品。鉴于乙偶姻广泛的应用价值及实现工业化生产的潜力,其被美国能源部认定为优先开发的30种平台化合物之一。2,3-丁二醇合成的另一前体化合物—双乙酰因具有强烈的奶油香气,作为增味剂广泛应用于在食品工业。目前商业上使用的乙偶姻及双乙酰大部分仍来源于化学合成,课题组前期筛选获得了一株可高效生产2,3-丁二醇的菌株阴沟肠杆菌SDM,本论文的第一个研究重点是:采用系统代谢工程技术手段改造阴沟肠杆菌SDM,获得高效乙偶姻及双乙酰生产菌株,实现基于生物质可再生资源的乙偶姻和双乙酰高效生产。包括芽孢杆菌属、沙雷氏属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属等在内的多种微生物都具有2,3-丁二醇合成基因簇,且均以2,3-丁二醇为主要发酵产物。研究者们在利用上述微生物高效生产2,3-丁二醇及其衍生化合物等方面取得了一系列进展,针对微生物为什么需要产生2,3-丁二醇,即“2,3-丁二醇合成的生理意义”这一问题,研究者提出了 3种可能的假设。本论文的第二个研究重点是:基因工程手段构建阴沟肠杆菌SDM的2,3-丁二醇合成阴性菌株,分析验证2,3-丁二醇合成突变对阴沟肠杆菌SDM代谢的影响,探究2,3-丁二醇合成对阴沟肠杆菌SDM的生理意义。论文第二章以阴沟肠杆菌SDM中含有的2,3-丁二醇合成基因簇为基础,采用代谢途径重构、还原力精细调控及碳源代谢阻遏效应消除三种代谢工程改造策略来实现乙偶姻的生物法高效生产。具体代谢工程改造流程如下:敲除乙偶姻还原酶编码基因budC,阻遏乙偶姻向2,3-丁二醇的还原反应,实现乙偶姻的积累;比较筛选NADH氧化酶、NADH脱氢酶及透明颤菌血红蛋白,确定NADH氧化酶可以更有效实现NAD+再生及胞内氧化还原状态向乙偶姻合成转移;全基因合成一系列启动子库实现NOX的差异表达,在实现胞内NADH/NAD+水平精细调控的基础上进一步促进乙偶姻的积累;敲除各副产物生成基因阻断各副产物的生成,增强乙偶姻得率;在分析菌株碳源代谢阻遏效应机理的基础上,敲除EIIBGlc编码基因ptsG,外源表达半乳糖透性酶基因gfalP,实现木质纤维素中最主要两种糖葡萄糖及木糖的同时且高效利用。通过系统代谢工程手段获得的基因工程菌株可以木质纤维素水解液为碳源,经过30 h发酵,积累得到45.6g L-1乙偶姻,乙偶姻生产效率为1.52 g L-1 h-1。论文第三章以阴沟肠杆菌SDM为出发菌株,通过代谢工程改造及化学法促进转化相结合,实现双乙酰的高效生产。首先,敲除α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC编码基因budA,阻断α-乙酰乳酸向乙偶姻的酶法催化,实现双乙酰前体物质—α-乙酰乳酸的积累;其次,敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因budC,减少双乙酰向乙偶姻及2,3-丁二醇的进一步还原。双敲除菌株经过12 h发酵,消耗15 gL-1葡萄糖,双乙酰浓度仅为59.8 mg L-1,双乙酰得率仅为理论最大得率的0.83%,而双乙酰的前体-α-乙酰乳酸的浓度高达2.94 g L-1,推测α-乙酰乳酸经过非酶促氧化脱羧生成双乙酰的效率是限制双乙酰积累的重要因素。因而进一步添加Fe3+以促进α-乙酰乳酸的非酶促氧化脱羧反应,最终双乙酰产量达到1.45g L-1,转化率为0.21 mol/mol,生产效率为0.13 gL-1 h-1。本章中双乙酰生产效率及产率均为目前报道生物法生产双乙酰的最高水平。论文第四章开展了阴沟肠杆菌SDM中2,3-丁二醇合成生理意义研究。首先验证了之前研究者关于2,3-丁二醇合成生理意义的三种假设,在部分否定前人假设的过程中,发现阴沟肠杆菌SDM并不具有细菌的乙酸代谢溢流表型,显示出乙酸溢流消除特征。通过基因敲除及发酵验证、同位素示踪等手段,发现阴沟肠杆菌中乙酸代谢溢流消除过程与2,3-丁二醇合成、乙醇产生过程直接相关。基于2,3-丁二醇合成与乙酸转化为乙醇涉及反应的分析,本章提出了一种2,3-丁二醇合成与乙醇产生配合实现乙酸代谢溢流消除的协同机制,并验证了其在不同微生物中存在的广泛性及普适性。通过β-半乳糖苷酶活性分析,RT-PCR等多种实验手段,对菌株SDM中包括2,3-丁二醇合成基因簇在内乙酸代谢溢流消除相关基因的转录调控机制进行了分析。