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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)早期特征性病理改变是血管内皮功能紊乱,主要表现为血管内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性下降,引起一氧化氮(Nitric oxide,NO)生成减少,造成内皮依赖性血管舒张功能障碍[1-4],研究表明,高胆固醇膳食可抑制内皮依赖性血管舒张,进而导致内皮功能紊乱,而血浆低密度脂蛋白(low density lipoproteins,LDL)浓度的升高及氧化增加是其导致AS的关键环节[5-7]。氧化型胆固醇(oxysterols),是胆固醇经氧化后产生的一类化合物,研究发现7-酮胆醇(7-ketocholesterol,7-KC)在血液循环中含量很低,但在AS斑块内含量极高,并与AS病理损伤密切相关[8-9]。
AMP激活性蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是机体内参与能量代谢重要的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,主要分布于肝脏、心脏及骨骼肌中,在细胞内以异三聚体形式存在,由一个α催化亚单位,两个调节亚单位β和γ组成[10]。AMPK激活抑制机体内合成代谢反应,如蛋白质、脂肪酸、胆固醇合成等；但却促进体内分解代谢,增加ATP的生成[11]。最近研究发现,AMPK同样存在于血管内皮细胞中,并参与eNOS活性稳态的调节及NO的生物合成,与内皮细胞的功能密切相关[12,13]。但迄今为止,有关AMPK激活对高胆固醇诱导内皮细胞功能紊乱的影响及其机制未见任何报道。
三磷酸腺苷结合盒转运体家族(ATP-binding cassette transporter,ABC)的ABCA1和ABCG1被认为是细胞胆固醇跨膜运输的两个关键转运子[14-16]。在转录水平两者均受肝脏核受体(liverⅩ receptorα,LⅩRα)的调控[17]。在转运胆固醇方面,两者有不同之处,ABCA1主要是促进游离胆固醇流向不含脂的受体,如apoAI或ApoE,而ABCG1更倾向于促进胆固醇和胆固醇酯流向高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)[17-19],因此转运能力明显强于ABCA1。此外,ABCG1能够通过HDL介导促进巨噬细胞氧化胆固醇特别是7-KC的流出[20]。这也是目前ABC家族中唯一被发现具有调节氧化胆固醇转运作用的分子。鉴于ABCG1在细胞胆固醇转运中的重要作用,以往大量的研究主要关注他在调节巨噬细胞胆固醇平衡,抑制巨噬泡沫细胞形成中的作用。近年来有研究发现,血管内皮细胞中也存在ABCG1表达[21],并可通过调节氧化胆固醇转运来维持血管内皮正常生理功能。因此如果能够上调血管内皮ABCG1表达将有利于保护血管功能,从而逆转高胆固醇所致血管内皮功能障碍,这也为AS的早期防治带来了新的契机和研究切入点。
研究假设:
AMPK可能通过促进血管内皮细胞ABCG1表达,介导胆固醇外流,缓解高胆固醇诱导的内皮细胞ROS生成及eNOS活性抑制。
实验方法
1、AMPK活化对HAECs内ABCG1表达的影响
为确定AMPK活化对ABCG1表达的影响,人体主动脉内皮细胞(Humanaortic endothelial cells,HAECs)暴露于不同浓度AMPK(0-2mmol/L)激动剂AICAR于不同时间段(0-24h)后,分别采用Northern blot、real time RT-PCR、Western blot检测ABCG1的表达。
由于AICAR是AMPK的非特异性激动剂,我们进一步观察了另外两种AMPK激动剂——二甲双胍(metformin)和A-769662对ABCG1表达的影响。将HAECs分别与二甲双胍(1 mM)和A-769662(100μM)培养8 h,提取总RNA和蛋白,用real time RT-PCR和Western blot方法检测ABCG1 mRNA和蛋白表达。
2、AMPK活化影响HAECs内ABCG1 mRNA表达的机制
研究表明,LⅩRα在ABCG1的上游,LⅩRα的转录活性增加会促进ABCG1的表达。为阐明AICAR诱导ABCG1表达是否依赖于LⅩRα介导作用,我们采用萤光素酶报道基因技术分析了LⅩRα反应元件在此过程的作用。
由于萤光素酶报道基因实验的阴性结果否定了AICAR诱导ABCG1表达过程中LⅩRα的特异性介导作用,我们推测AICAR对ABCG1 mRNA表达的诱导可能是通过转录后的调节机制。故我们进一步测定了AICAR作用后细胞中ABCG1 mRNA T1/2的变化。HAECs经溶剂对照或1mmol/LAICAR处理24h后,加入放线菌素D处理不同时间以终止转录。然后采用Northern Blot分析ABCG1mRNA的表达,并将放线菌素D处理后各时间点ABCG1 mRNA剩余百分数的对数与时间作图,并通过软件计算ABCG1 mRNA T1/2.
3、AMPK活化对HAECs内胆固醇及7-KC外流的影响
将HAECs单独以胆固醇(10μg/mL)或7-KC(10μg/mL)处理,或与AICAR(0.25～2.0 mM)共同培养24h,PBS清洗后再与20μg/mL HDL孵育16h,然后收集细胞和培养液,加入胆固醇分析液后,采用荧光分光光度计检测细胞、培养液中胆固醇或氧化胆固醇(7-KC)的含量。
为证实在此过程中AMPK、ABCG1的特异性介导作用,我们分别采用AMPK抑制剂compound C及ABCG1 siRNA预处理,然后观察对AICAR诱导HAECs胆固醇、7-KC外流的影响。
4、AMPK活化对HAECs内氧化应激、eNOS活性的影响
通过采用carboxy-H2DCFDA(Invitrogen)检测HAECs内ROS水平,GSH/GSSG ratio assay kit(Caibiochem)检测GSH/GSSG比值,NOS Assay Kit(Calbiochem)检测eNOS活性,cyclic GMP ELA KIT(Cayman chemical)检测cGMP水平,并结合ABCG1 SiRNA技术,我们观察了1mmol/L AICAR同处理24h对7-KC(10μg/mL)诱导HAECs氧化应激、eNOS活性抑制及NO生成减少的影响,并特异性评价ABCG1在此过程中的特异性介导作用。
结论
1.AMPK活化通过增NABCG1 mRNA的稳定性特异性上调体外培养的内皮细胞ABCG1 mRNA和蛋白的表达。
2.AMPK活化促进血管内皮细胞胆固醇和氧化胆固醇的外流,减轻内皮细胞氧化应激水平,维持eNOS的活性以及cGMP的产生。