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目的:透明带(zona pellucida,ZP)是围绕在哺乳动物卵母细胞周围的一层包外基质,在精卵结合、诱导顶体反应及阻止多精入卵中起着关键作用。人的透明带主要由4种卵膜糖蛋白(ZPl、ZP2、ZP3和ZP4)组成,其中ZP4在精卵特异性识别与结合、防止多精入卵、诱发顶体反应、保证ZP完整性以及保护卵细胞和着床前的胚胎等发挥重要作用。人类ZP4因其在精卵结合的起始过程和诱导精子顶体反应中起着重要的作用,被定义为结合精子的起始受体。然而,尚未有关于原核细胞中表达的hZP4与非获能精子于体外结合的相关研究报道,同时国内对于制备抗hZP4的多克隆抗体的研究也较少。因此,依据ZP4和精子的生物学特点及两者组成的配体-受体相互作用特性,本研究通过原核细胞表达重组人ZP4,探究ZP4与未获能精子的体外结合效率,为本课题组的后续研究中对法医学混合斑的鉴定提供基础;本研究也将利用纯化的重组人ZP4免疫新西兰兔,制备抗血清,为后续研究提供实验基础。研究方法:构建pGEX-4T-1-ZP4-His原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达GST-ZP4-His融合蛋白,利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析纯化GST-ZP4-His融合蛋白,纯化后的ZP4蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,分别采用ELISA和Western blot检测血清效价及特异性。纯化的ZP4融合蛋白与未获能精子进行体外结合,荧光显微镜下观察ZP4与精子共定位,利用抑制实验验证ZP4与精子的结合效率。结果:1、在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达GST-ZP4-His融合蛋白,纯化得到重组hZP4目的蛋白。2、以该融合蛋白免疫新西兰兔获得粗制多克隆抗ZP4的抗血清。3、免疫荧光结果未发现原核表达的重组人ZP4蛋白在体外与未获能精子结合,抑制实验结果显示ZP4蛋白与未获能精子在结合前和结合后的曲线相近,差别较小。结论:1、成功获得原核表达的GST-ZP4-His融合蛋白。2、制备的兔抗人ZP4抗血清效价较高,但特异性较差。3、未发现原核表达的重组人ZP4蛋白与未获能精子在体外结合。