论文部分内容阅读
茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是一类S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基转移酶,主要参与木质素和甲基化EGCGs的生物合成。本研究克隆了茶树CCoAOMT基因,优化了 CCoAOMT诱导表达条件,对其酶学性质进行了研究,并采用PCR目的区域扩增结合Sanger测序的方法分析其单核苷酸多态性。主要研究结果如下:1、以金牡丹茶树品种为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出茶树CCoAOMT基因编码区全序列,并将其克隆到表达载体pET-28a中,得到重组质粒pET-CCoAOMT,将重组质粒在表达宿主菌B121(DE3)中高效表达,得到相对分子量约为28KDa的重组蛋白。重组表达菌株在IPTG浓度为0.5mM,诱导温度为37℃,诱导时间为4H时,诱导表达效果最佳。2、体外酶促反应表明,CCoAOMT重组蛋白能催化EGCG合成EGCG3”Me。结果表明,该酶的最适反应温度为37℃,最适pH为4,以EGCG为反应底物,最佳浓度为 0.05mmol/LEGCG。3、本研究以茶树GAPDH为内参基因,对不同茶树品种中CCoAOMT基因表达进行了比较分析。结果表明,CCoAOMT基因在肉桂、迎春、赤叶奇兰、毛蟹品种中表达量较高,其中在肉桂品种中表达水平最高。4、本研究对25个茶树品种的CCoAOMT基因进行了 SNP分析。外显子SNPs位点有16个,即平均每46个碱基出现1个SNP。从第1至第4扩增区段SNP的出现频率分别是:1.24%,3.61%,0.54%,1.53%,第2扩增区段SNP出现的频率最高。在16个SNPs位点中,存在11个转换变异,占68.8%,5个颠换变异,占31.2%,转换类型是A(?)G,C(?)T,颠换类型是A→C,A(?)T,G(?)C。在16个SNP位点中,有2个同义突变位点,14个错义突变位点导致氨基酸的改变,同时,包含3个位点为延长突变。