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凝集素表现出很多的活性,包括抗肿瘤,免疫调节,抗真菌,HIV-1逆转录酶抑制,和抗虫的性质等,有些还显示出抗菌和抗线虫的性质,在实际中有很大的应用前景。但是从原材料中提取纯化耗时费力,受原材料来源的限制,产量不高。使用大肠杆菌表达中国水仙凝集素的结果表明,重组蛋白较大一部分是以包涵体形式存在的,所以本论文研究了中国水仙凝集素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。
本研究首先将中国水仙凝集素基因克隆到pPIC9K-T载体(本实验室构建)上,成功构建了毕赤酵母GS115 pPIC9K-NTL,但是SDS-PAGE电泳没有检测到明显的蛋白表达。通过对稀有密码子的检查,检查结果发现有使用频率为10-20%的密码子17个,使用频率为10%密码子18个,因此利用DNA Works等软件合成了偏好于毕赤酵母的新凝集素基因(NTL-opt)。将优化后的水仙凝集素基因NTL-opt与pPIC9K-T载体连接,成功构建进毕赤酵母中,使用MD缺陷型培养基筛选,再使用PCR的方法进行验证酵母基因组,结果显示6个转化子中有3个为阳性,成功得到重组毕赤酵母GS115(pPIC9K-NTL-opt)。
挑取一株单克隆重组毕赤酵母GS115(pPIC9K-NTL-opt),使用BMGY/BMMY有机培养基进行表达,SDS-PAGE和Western blotting结果显示蛋白得到了成功表达。简单对比了有机培养基和无机培养基的表达,蛋白产量并没有明显差异,因此选用无机盐培养基作为后期上罐发酵的培养基。使用bandscan等软件计算得到目标蛋白占总蛋白含量的80%以上。
重组凝集素的性质研究显示,与天然凝集素凝集活性4.76相比,重组水仙凝集素凝集活性为4.39,凝集活性相近;使用圆二色谱的方法分别测定天然和重组凝集素的二级结构,结果显示二者二级结构相似;对重组凝集素进行去糖基化研究,结果显示重组蛋白没有明显的糖基化作用。以上结论表明,重组水仙凝集素与天然水仙凝集素性质相似。
在重组水仙凝集素毕赤酵母菌株构建成功及蛋白初步表达成功的基础上,使用5L的发酵罐进行了简单的发酵表达,发酵的基本条件为pH5.6,温度28℃,转速600rpm。研究了发酵过程中菌浓度,甘油浓度,铵离子浓度的变化。菌体在甘油为碳源的条件下生长迅速,加入甲醇进行诱导表达后生长较缓慢,菌浓度在发酵罐中可以达到OD600为290。初始甘油浓度为30g/L,在20h急速下降,40h时基本耗尽,也是此时开始加入甲醇进行诱导。中国水仙凝集素在此次表达中达到了较高的表达量,发酵液中的总蛋白含量最高可达到1000mg/L。