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目的:化风丹是贵州具有300余年历史的传统丸剂，处方由紫苏叶、僵蚕、企蝎、制天南星等14味中药与药母组成。具有息风镇痉、豁痰开窍的功效，主要用于治疗风痰闭阻、中风偏瘫、癫痈、面神经麻痹、口眼歪斜等症。处方中特有的药母由牛胆汁、川鸟、半夏、天南星、白附子、郁金、神曲等7味中药组成，其中生川乌、生半夏、生天南星、生白附子为有毒中药，古法对药母进行自然发酵以解毒增效。本实验对发酵过程中化风丹药母的主要化学成分的含量进行测定:建立发酵过程中化风丹药母的HPLC指纹图谱:对化风丹药母发酵中细菌及真菌等微生物多样性进行研究;初步考察发酵对药母毒性药物的减毒作用:并对化学成分变化与微生物种类及变化进行相关性分析。以期发现毒性药物生物发酵过程中化学成分、微生物变化及其相互作用，为阐释毒性药物发酵减毒增效作用机制和物质基础提供参考。
方法:1.化风丹药母的物理指标测定:按照《中国药典》规定，采用精密酸度计、台式干燥箱等仪器测定1)发酵用牛胆汁的物理指标:2)化风丹药母在发酵过程中pH值:3)化风丹药母发酵过程中水分。
2.化风丹药母指纹图谱的建立:1)采用HPLC法，测定生川乌中单/双酯型生物碱:2)采用HPLC法，考察化风丹药母中主要化学成分单酯型生物碱(苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱)、双酯型生物碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱)的含量变化;3)采用HPLC法，建立化风丹药母指纹图谱，将每个发酵阶段化风丹药母相应的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行相似度评价。
3.化风丹药母微生物多样性研究:采用高通量测序技术分析化风丹药母在发酵过程中的微生物(真菌/细菌)多样性，通过微生态NMDS分析、热谱图、细菌群落Lefse分析、PCA主成分分析、PCoA主坐标分析等方法研究分析化风丹药母在发酵过程中的细菌群落丰度、多样性、差异性。
4.化风丹药母发酵的减毒作用:采用急性毒性试验，观察小鼠的外观症状，测定小鼠的死亡率、体质量、进食量及各个脏器指数，并对各个脏器进行病理切片，初步研究化风丹药母的发酵减毒作用。
5.化风丹药母发酵中物质变化与微生物的双变量相关分析:1)药母发酵中pH与微生物的关系:2)药母发酵中物质变化与微生物的关系:3)药母发酵中菌落间变化及关系。
结果:1.化风丹药母的物理指标测定:1)发酵用牛胆汁的物理指标:牛胆汁的pH值在6.77～6.98之间，均值为6.87;密度在0.9177～0.9873g/ml,均值为0.9510g/ml;固形物在0.0366～0.0457g/ml之间，均值为0.0409g/ml;水分在0.9543～0.9634g/ml,均值为0.9591g/ml;2)化风丹药母在发酵过程中pH值:12批药母在发酵初始，pH值接近，随着发酵周期的延长，12批药母在同一周期中其pH值个别差异性相对较大，同一批药母在发酵过程中，pH值先是瞬间下降，一周后呈现上升趋势;3)化风丹药母发酵过程中水分:12批药母在发酵过程中，含水量在任何发酵周期中差异性不大，同一批药母在发酵过程中，含水量差异性也不大。
2.化风丹药母指纹图谱的建立:1)生川乌中单/双酯型生物碱:测得单酯型生物碱百分含量在0.0313％～0.0726％之间，均值为0.0514;双酯型生物碱百分含量在0.0396％～0.1904％之间，均值为0.1282;2)化风丹药母中单/双酯型生物碱:测得药母发酵初始至发酵终止12批药母单/双酯型生物碱变化结果分别为:单酯型总生物碱的百分含量变化范围分别为:S1为58811～10.3822mg/g,S2为4.4952～7.2324mg/g,S3为2.8564～8.1244mg/g,S4为3.0677～4.7489mg/g,S5为3.9283～6.5305mg/g,S6为5.6605～7.5584mg/g,S7为5.1752～7.0174mg/g,S8为2.5864～4.2539mg/g,S9为6.8578～9.6630mg/g,S10为4.5209～7.3630mg/g;,S11为3.8781～5.9262mg,S12为4.7804～6.8736mg/g;双酯型总生物碱的百分含量变化范围分别为:S1为2.1478～14.4237mg/g,S2为9.9334～5.1370mg/g,S3为16.3635～8.2793mg/g,S4为162096～9.7507mg/g,S5为11.6296～5.0558mgg S6为83325～3.9768mg/g,S7为13.5669～S.2443mg/g,S8为20.0371～8.522mg/g,S9为18.7750～10.1199mg/g,S10为12.4020～6.3540mgg,S11为20.7870～10.29592mg/g,S12为22.7536～1.259mg/g,3)化风丹药母指纹图谱的建立:建立了发酵过程中化风丹药母的HPLC指纹图谱，以相对保留时间确定共有峰，通过对照品的指认，确定了已知的6个化学成分，分别为苯甲酰乌头碱，苯甲酰新乌头碱，苯甲酰次乌头碱，乌头碱，新乌头碱，次乌头碱。
3.化风丹药母发酵中微生物多样性研究:采用高通量测序法，得出细菌在发酵过程中的Coverage指数均大于0.99,因此样品的测序结果真实可靠，Chao指数和Ace指数均表明了发酵0周的化风丹药母的丰度最高，发酵3周时最低，Shannon值与Simpson值均表明发酵0周的化风丹药母的多样性最高，发酵3周时最低。共检测出厚壁菌门(Fimicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)等14门，片球菌属(ediococcus)、芽孢杆菌属(Baillus)等299属。得出真菌在发酵过程中的Coverage指数均大于0.99,因此样品的测序结果真实可靠，Chao指数和Ace指数均表明了发酵0周的化风丹药母的丰度最高，发酵4周时最低，Shannon值与Simpson值均表明发酵0周的化风丹药母的多样性最高，发酵4周时最低,共检测出子囊菌门(Ascomycota)、担子菌亚门(Basidiomycota)等23个门，毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomycopsis)等57属;并测定了化风丹药母在发酵过程中主要细菌和真菌含量的变化情况。
4.化风丹药母发醉的减毒作用:在小鼠急性毒性实验研究中，通过测定化风丹药母对小鼠的死亡率、进食量、体质量、脏器系数等指标，得出不同发酵周期化风丹药母对小鼠最大给药量分别为:发酵0周与3周为13.11gkg,发酵6周为16.38g/kg。
5.化风丹药母发酵中物质变化与微生物的双变量相关分析:1)药母发酵中pH与微生物的关系:物质变化与细菌关联中，pH与片球菌属的变化之间呈负向直线关系;与真菌关联中，pH与散囊菌属的变化之间呈正向直线关系:2)药母发酵中物质变化与微生物的关系:物质变化与细菌关联中，双酯型生物碱与厚壁菌门呈负向直线关系，与变形杆菌门和肠杆菌属呈正向直线关系:与真菌关联中，双酯型生物碱与子囊菌门之间呈负向直线关系，与酵母属呈正向直线关系;3)药母发酵中菌落间变化及关系:在细菌门水平上，厚壁菌门与变形杆菌门呈负向直线关系，属水平上芽孢杆菌属与肠杆菌属呈正向直线关系;在真菌门水平上，子囊菌门与担子菌亚门呈负向直线关系，属水平上无显著性相关。
结论:研究结果表明:不同发酵阶段化风丹药母pH值呈现出先降低后升高的趋势，水分变化差异不大:双酯型生物碱的含量总和下降，单酯型的生物碱含量总和增加:建立不同发酵阶段的指纹图谱:测定了化风丹药母在发酵过程中主要细菌和真菌含量的变化情况，在细菌属水平上芽孢杆菌属(Bacillus)在发酵初始为优势菌种，在发酵一周后片球菌属(Pediococcus)为主要的优势菌种;在真菌属水平上发酵一周内酵母属(Saccharomycopsis)为优势菌种，发酵一周后毕赤酵母属(Pichia)为主要的优势菌种，微生物菌群多样性、丰度及比例等均存在显著(P＜0.05)差异:急性毒性试验的研究，初步判断化风丹药母在发酵之后其毒性有所下降。基于双变量相关分析评价物质变化与微生物多样性的关系，初步判断化风丹药母在发酵之后其毒性有所下降。为化风丹药母发醇减毒提供实验依据，为化风丹药母现代发酵菌种选择提供依据并为有毒中药复方炮制提供新思路。
方法:1.化风丹药母的物理指标测定:按照《中国药典》规定，采用精密酸度计、台式干燥箱等仪器测定1)发酵用牛胆汁的物理指标:2)化风丹药母在发酵过程中pH值:3)化风丹药母发酵过程中水分。
2.化风丹药母指纹图谱的建立:1)采用HPLC法，测定生川乌中单/双酯型生物碱:2)采用HPLC法，考察化风丹药母中主要化学成分单酯型生物碱(苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱)、双酯型生物碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱)的含量变化;3)采用HPLC法，建立化风丹药母指纹图谱，将每个发酵阶段化风丹药母相应的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行相似度评价。
3.化风丹药母微生物多样性研究:采用高通量测序技术分析化风丹药母在发酵过程中的微生物(真菌/细菌)多样性，通过微生态NMDS分析、热谱图、细菌群落Lefse分析、PCA主成分分析、PCoA主坐标分析等方法研究分析化风丹药母在发酵过程中的细菌群落丰度、多样性、差异性。
4.化风丹药母发酵的减毒作用:采用急性毒性试验，观察小鼠的外观症状，测定小鼠的死亡率、体质量、进食量及各个脏器指数，并对各个脏器进行病理切片，初步研究化风丹药母的发酵减毒作用。
5.化风丹药母发酵中物质变化与微生物的双变量相关分析:1)药母发酵中pH与微生物的关系:2)药母发酵中物质变化与微生物的关系:3)药母发酵中菌落间变化及关系。
结果:1.化风丹药母的物理指标测定:1)发酵用牛胆汁的物理指标:牛胆汁的pH值在6.77～6.98之间，均值为6.87;密度在0.9177～0.9873g/ml,均值为0.9510g/ml;固形物在0.0366～0.0457g/ml之间，均值为0.0409g/ml;水分在0.9543～0.9634g/ml,均值为0.9591g/ml;2)化风丹药母在发酵过程中pH值:12批药母在发酵初始，pH值接近，随着发酵周期的延长，12批药母在同一周期中其pH值个别差异性相对较大，同一批药母在发酵过程中，pH值先是瞬间下降，一周后呈现上升趋势;3)化风丹药母发酵过程中水分:12批药母在发酵过程中，含水量在任何发酵周期中差异性不大，同一批药母在发酵过程中，含水量差异性也不大。
2.化风丹药母指纹图谱的建立:1)生川乌中单/双酯型生物碱:测得单酯型生物碱百分含量在0.0313％～0.0726％之间，均值为0.0514;双酯型生物碱百分含量在0.0396％～0.1904％之间，均值为0.1282;2)化风丹药母中单/双酯型生物碱:测得药母发酵初始至发酵终止12批药母单/双酯型生物碱变化结果分别为:单酯型总生物碱的百分含量变化范围分别为:S1为58811～10.3822mg/g,S2为4.4952～7.2324mg/g,S3为2.8564～8.1244mg/g,S4为3.0677～4.7489mg/g,S5为3.9283～6.5305mg/g,S6为5.6605～7.5584mg/g,S7为5.1752～7.0174mg/g,S8为2.5864～4.2539mg/g,S9为6.8578～9.6630mg/g,S10为4.5209～7.3630mg/g;,S11为3.8781～5.9262mg,S12为4.7804～6.8736mg/g;双酯型总生物碱的百分含量变化范围分别为:S1为2.1478～14.4237mg/g,S2为9.9334～5.1370mg/g,S3为16.3635～8.2793mg/g,S4为162096～9.7507mg/g,S5为11.6296～5.0558mgg S6为83325～3.9768mg/g,S7为13.5669～S.2443mg/g,S8为20.0371～8.522mg/g,S9为18.7750～10.1199mg/g,S10为12.4020～6.3540mgg,S11为20.7870～10.29592mg/g,S12为22.7536～1.259mg/g,3)化风丹药母指纹图谱的建立:建立了发酵过程中化风丹药母的HPLC指纹图谱，以相对保留时间确定共有峰，通过对照品的指认，确定了已知的6个化学成分，分别为苯甲酰乌头碱，苯甲酰新乌头碱，苯甲酰次乌头碱，乌头碱，新乌头碱，次乌头碱。
3.化风丹药母发酵中微生物多样性研究:采用高通量测序法，得出细菌在发酵过程中的Coverage指数均大于0.99,因此样品的测序结果真实可靠，Chao指数和Ace指数均表明了发酵0周的化风丹药母的丰度最高，发酵3周时最低，Shannon值与Simpson值均表明发酵0周的化风丹药母的多样性最高，发酵3周时最低。共检测出厚壁菌门(Fimicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)等14门，片球菌属(ediococcus)、芽孢杆菌属(Baillus)等299属。得出真菌在发酵过程中的Coverage指数均大于0.99,因此样品的测序结果真实可靠，Chao指数和Ace指数均表明了发酵0周的化风丹药母的丰度最高，发酵4周时最低，Shannon值与Simpson值均表明发酵0周的化风丹药母的多样性最高，发酵4周时最低,共检测出子囊菌门(Ascomycota)、担子菌亚门(Basidiomycota)等23个门，毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomycopsis)等57属;并测定了化风丹药母在发酵过程中主要细菌和真菌含量的变化情况。
4.化风丹药母发醉的减毒作用:在小鼠急性毒性实验研究中，通过测定化风丹药母对小鼠的死亡率、进食量、体质量、脏器系数等指标，得出不同发酵周期化风丹药母对小鼠最大给药量分别为:发酵0周与3周为13.11gkg,发酵6周为16.38g/kg。
5.化风丹药母发酵中物质变化与微生物的双变量相关分析:1)药母发酵中pH与微生物的关系:物质变化与细菌关联中，pH与片球菌属的变化之间呈负向直线关系;与真菌关联中，pH与散囊菌属的变化之间呈正向直线关系:2)药母发酵中物质变化与微生物的关系:物质变化与细菌关联中，双酯型生物碱与厚壁菌门呈负向直线关系，与变形杆菌门和肠杆菌属呈正向直线关系:与真菌关联中，双酯型生物碱与子囊菌门之间呈负向直线关系，与酵母属呈正向直线关系;3)药母发酵中菌落间变化及关系:在细菌门水平上，厚壁菌门与变形杆菌门呈负向直线关系，属水平上芽孢杆菌属与肠杆菌属呈正向直线关系;在真菌门水平上，子囊菌门与担子菌亚门呈负向直线关系，属水平上无显著性相关。
结论:研究结果表明:不同发酵阶段化风丹药母pH值呈现出先降低后升高的趋势，水分变化差异不大:双酯型生物碱的含量总和下降，单酯型的生物碱含量总和增加:建立不同发酵阶段的指纹图谱:测定了化风丹药母在发酵过程中主要细菌和真菌含量的变化情况，在细菌属水平上芽孢杆菌属(Bacillus)在发酵初始为优势菌种，在发酵一周后片球菌属(Pediococcus)为主要的优势菌种;在真菌属水平上发酵一周内酵母属(Saccharomycopsis)为优势菌种，发酵一周后毕赤酵母属(Pichia)为主要的优势菌种，微生物菌群多样性、丰度及比例等均存在显著(P＜0.05)差异:急性毒性试验的研究，初步判断化风丹药母在发酵之后其毒性有所下降。基于双变量相关分析评价物质变化与微生物多样性的关系，初步判断化风丹药母在发酵之后其毒性有所下降。为化风丹药母发醇减毒提供实验依据，为化风丹药母现代发酵菌种选择提供依据并为有毒中药复方炮制提供新思路。