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目的：通过应用大黄和吗啡构建两种具有不同临床意义的慢传输型便秘模型，并基于该模型证实miR-128在STC模型中的表达变化并验证miR-128作用的下游信号通路及该信号通过对STC发病过程中的作用及分子机制。
方法：通过吗啡10mg/kg/天皮下注射，300mg/kg/天大黄汤喂饲的方式构建慢传输便秘模型，结肠传输实验证实造模成功。造模成功后应用qPCR法检测小鼠结肠组织中miR-128表达水平，应用qPCR及WesternBlot等方法检测ICC细胞标志物SCF及肠神经系统标志物NSE。应用生物信息学方法对miR-128下游靶基因及通路进行预测并在慢传输型便秘模型检测预测下游通路指标p38α、AKT、M-CSF水平进行验证。此后通过在CT26.WT细胞上使用micrONmmu-miR-128-2-5pmimic、micrOFFmmu-miR-128-2-5pinhibitor进行转染验证miR-128是否为p38α的直接调控因子，及miR-128能否调节结肠上皮细胞M-CSF的表达。通过qPCR、WesternBlot等方式检测慢传输型便秘模型中炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平判断结肠炎症状况。将micrONmmu-miR-128-2-5pmimic、micrOFFmmu-miR-128-2-5pinhibitor转染后的CT26.WT同RAW264.7共培养后检测培养基中M-CSF水平及RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6等炎症因子的表达量从而确定miR-128所引用的M-CSF水平变化对巨噬细胞的影响。
结果：依据造模工具药物的不同，造模小鼠被分为生理盐水组、吗啡组、大黄组、吗啡+大黄组。经结肠传输实验验证，大黄组与吗啡+大黄组出现结肠传输减缓，提示出现“泻剂结肠”现象，其中吗啡+大黄组被定义为STC组。此外我们发现STC组粪便含水量显著下降。“泻剂结肠”模型中的结肠组织中SCF及NSE水平显著下降，提示肠道ICC细胞结构功能受损及ENS损伤。STC组与大黄组检出miR-128水平的显著下降且在STC组及大黄组中发现p38α、M-CSF表达的显著提高，使用miR-128mimic及inhibitor对CT26.WT细胞miR-128进行干扰，证实p38α、AKT是miR-128调控的下游通路，M-CSF水平亦受miR-128调控。STC组及大黄组结肠组织中TNF-α、IL-6表达大幅升高，共培养后发现miR-128inhibitor处理后的M-CSF分泌显著提高，且RAW264.7细胞表达的TNF-α、IL-6出现上调；在使用miR-128mimic对CT26.WT细胞进行干扰后，M-CSF分泌水平出现下调，共培养后的RAW264.7细胞表达较低水平的TNF-α及IL-6。上述结果提示肠道上皮细胞中miR-128引起的M-CSF表达水平变化可以引起巨噬细胞炎症介质释放改变。
结论：成功构建慢传输型便秘小鼠模型，通过应用该模型并结合细胞实验初步证实miR-128可能通过靶向p38α调节肠道上皮细胞M-CSF的表达释放，促进STC结肠组织炎症细胞(如巨噬细胞)浸润以及炎症因子表达增加，从而因此结肠免疫微环境改变，并可能因此造成ICC损伤，参与结肠STC的发病。
方法：通过吗啡10mg/kg/天皮下注射，300mg/kg/天大黄汤喂饲的方式构建慢传输便秘模型，结肠传输实验证实造模成功。造模成功后应用qPCR法检测小鼠结肠组织中miR-128表达水平，应用qPCR及WesternBlot等方法检测ICC细胞标志物SCF及肠神经系统标志物NSE。应用生物信息学方法对miR-128下游靶基因及通路进行预测并在慢传输型便秘模型检测预测下游通路指标p38α、AKT、M-CSF水平进行验证。此后通过在CT26.WT细胞上使用micrONmmu-miR-128-2-5pmimic、micrOFFmmu-miR-128-2-5pinhibitor进行转染验证miR-128是否为p38α的直接调控因子，及miR-128能否调节结肠上皮细胞M-CSF的表达。通过qPCR、WesternBlot等方式检测慢传输型便秘模型中炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平判断结肠炎症状况。将micrONmmu-miR-128-2-5pmimic、micrOFFmmu-miR-128-2-5pinhibitor转染后的CT26.WT同RAW264.7共培养后检测培养基中M-CSF水平及RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6等炎症因子的表达量从而确定miR-128所引用的M-CSF水平变化对巨噬细胞的影响。
结果：依据造模工具药物的不同，造模小鼠被分为生理盐水组、吗啡组、大黄组、吗啡+大黄组。经结肠传输实验验证，大黄组与吗啡+大黄组出现结肠传输减缓，提示出现“泻剂结肠”现象，其中吗啡+大黄组被定义为STC组。此外我们发现STC组粪便含水量显著下降。“泻剂结肠”模型中的结肠组织中SCF及NSE水平显著下降，提示肠道ICC细胞结构功能受损及ENS损伤。STC组与大黄组检出miR-128水平的显著下降且在STC组及大黄组中发现p38α、M-CSF表达的显著提高，使用miR-128mimic及inhibitor对CT26.WT细胞miR-128进行干扰，证实p38α、AKT是miR-128调控的下游通路，M-CSF水平亦受miR-128调控。STC组及大黄组结肠组织中TNF-α、IL-6表达大幅升高，共培养后发现miR-128inhibitor处理后的M-CSF分泌显著提高，且RAW264.7细胞表达的TNF-α、IL-6出现上调；在使用miR-128mimic对CT26.WT细胞进行干扰后，M-CSF分泌水平出现下调，共培养后的RAW264.7细胞表达较低水平的TNF-α及IL-6。上述结果提示肠道上皮细胞中miR-128引起的M-CSF表达水平变化可以引起巨噬细胞炎症介质释放改变。
结论：成功构建慢传输型便秘小鼠模型，通过应用该模型并结合细胞实验初步证实miR-128可能通过靶向p38α调节肠道上皮细胞M-CSF的表达释放，促进STC结肠组织炎症细胞(如巨噬细胞)浸润以及炎症因子表达增加，从而因此结肠免疫微环境改变，并可能因此造成ICC损伤，参与结肠STC的发病。