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JEV属于黄病毒科黄病毒属，单股正链RNA病毒，基因组大小约11kb，仅含有一个开放阅读框，编码3个结构蛋白，7个非结构蛋白。JEV引起的日本脑炎是一种经蚊虫传播的人畜共患传染病。猪细小病毒是猪的繁殖障碍性疾病的主要病原之一，可导致母猪的流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎等繁殖障碍性疾病，该病在我国猪场中普遍存在，给养猪业带来了严重的损失。目前尚无治疗日本脑炎和猪细小病毒病的特效药物，因此开展病毒机理研究和研制安全有效的新型疫苗有着重要的意义。本研究分为两个部分，第一部分：把JEV E蛋白上4个B细胞表位和一个CTL表位及一个Th表位基因与猪细小病毒结构蛋白基因VP2串联起来，构建入原核表达载体pCold-I，在E.coliBL21中诱导表达。重组蛋白纯化后，体外组装成病毒样颗粒后免疫小鼠研究其免疫原性。第二部分将JEV的全基因组分成三个重叠的片段，分别扩增出来，以这三个片段为模板，通过融合PCR方法，获得JEV的全长cDNA。拯救JEV病毒。从基因水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定，并测定恢复病毒的生物学特性。具体研究内容如下：1.展示JEV多B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒病毒样颗粒的制备根据文献报道及多表位疫苗的构建策略，选取JEV E蛋白上的4个B细胞表位(aa150-156,aa307-316, aa327-333, aa386-399)和2个T细胞表位（aa60-68, aa436-445），各表位间用甘氨酸和脯氨酸分开，使各表位相对独立并有利于抗原的递呈。同时为了使JEV表位疫苗的免疫原性提高，增强其免疫效果，将他们的序列与猪细小病毒VP2蛋白基因的5’端相连接，并插入到原核表达质粒pCold-Ⅰ中，构建重组质粒pMEP-VP2，热击转化大肠杆菌BL2（1DE3），使重组蛋白MEP-VP2得以表达。Western Blot分析表明，重组蛋白能被抗PPV多抗和抗JEV多抗识别。电镜观察结果显示，在体外表达的重组蛋白MEP-VP2在一定条件下能够自我组装成病毒样颗粒PPV:VLP(JEV)。2.展示JEV多B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒病毒样颗粒在小鼠模型上的原性评价4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成6组，每组10只。将JEV-MEP多肽、PPV-VP2蛋白、PPV:VLP(JEV)颗粒、商品化JEV灭活苗、商品化PPV灭活苗和PBS分别以腹腔接种的方式给小鼠进行3次免疫。通过测定抗体和CTL来衡量PPV:VLP(JEV)颗粒的免疫效果。结果表明，PPV:VLP(JEV)颗粒能诱导JEV特异性的体液免疫和细胞免疫和PPV特异性的体液免疫。3. JEV弱毒疫苗株全长cDNA的体外合成及恢复病毒的拯救本实验中，首先将病毒的全基因组分成三个重叠的区段，分别扩增出来，把这三个片段连接到载体中。以这三个片段为模板，通过融合PCR方法，获得JEV的全长cDNA。以cDNA为体外转录的模板，体外转录获得病毒mRNA，转染BHK-21细胞，拯救JEV病毒。从基因水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定，并测定恢复病毒的生长曲线。结果获得了全长cDNA，体外转录获得的病毒RNA，转染BHK-21细胞后，二代恢复病毒可引起明显的细胞病变，间接免疫荧光实验和RT-PCR均为阳性。空斑试验表明拯救病毒与原病毒空斑表型类似；恢复病毒与亲本毒相比在BHK-21细胞上生长更快。综上所述，展示JEV多B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒病毒样颗粒能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，从而为研究安全有效的JEV和PPV二联疫苗提供了新的思路和方法；以PCR为基础的构建JEV全长cDNA，为研究病毒基因复制、转录、组装、病毒与细胞的相互作用及标记疫苗提供工具。