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为深入研究国内圆斑蝰蛇毒中凝血因子X激活剂作用成份的生物学特性及应用前景,我们于2004.3~2005.3在北京昭衍新药研究中心对从广西产的圆斑蝰(Viperarussellii)蛇毒中分离纯化出的WK-B进行了药理、毒理学研究。研究主要内容包括NWK-B的生物活性检测以及止血作用、时效关系和安全性等,为能将其开发为一种新型的止血药物而提供一些基础资料,充分实现我国蛇毒资源的利用价值。本次研究方法及结论如下:1.通过FXa与特异性底物S2765的显色反应,可以清楚地明白NWK-B的作用机制,即NWK-B在Ca2+存在的情况下,能激活凝血因子X(FX),使其转变为有活性的FXa,后者进一步激活凝血酶原,从而产生止血作用。
2.采用肉眼观察血浆初凝时间的方法,判断何种环境可以使NWK-B产生最佳的凝血活性。根据结果我们可以看到NWK-B在Ca2+终浓度为12.5mM、37℃、pH7.440mMTris-HCl缓冲液的环境中的凝血活性最高。
3.根据对昆明小鼠和Wistar大鼠的药效学试验可以看出,极小剂量的NWK-B就可以明显缩短出血时间,例如剂量为0.00125U/Kg的NWK-B可以缩短小鼠正常出血时间的27.6%,而且可以显著缩短全血凝固时间(CT)、血浆复钙时间(RT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),同时增加纤维蛋白原(FIB)含量、延长优球蛋白溶解时间(ELT),使血液呈现高凝状态,而对血小板数量(PLT)却没有显著影响,说明不会产生弥散性血管内凝血(DIC)症状。
4.在Beagle犬体内,不论剂量大小,NWK-B都是在药后1h可以使血浆复钙时间(RT)达到最小,从而呈现出最佳止血效果。
5.将该药物以最大浓度1000U/Kg给于20只昆明小鼠,仅使一只小鼠死亡,故可认为该剂量为小鼠的最大耐受剂量。而在Wistar大鼠急性毒性试验中,表现出对该药物的敏感性,动物中毒症状明显,给药的剂量5U/Kg就可以导致动物死亡,经病理解剖,死因可能是DIC引起的出血及多器官衰竭,主要为肺出血及肝细胞坏死。对于Beagle犬的急性毒性试验,给药剂量为1125U/Kg的两只动物在药后短期内一些凝血指标均出现异常,说明产生了DIC,但在试验结束时都恢复到正常水平,这个实验中没有动物死亡,可以认为NWK-B给予Beagle犬的MTD为1125U/Kg。。
总之,从广西产圆斑蝰蛇毒中分离纯化出的NWK-B极小剂量就具有明显的止血、凝血作用,而且安全范围大,在医药领域中具有重大的应用价值。