【摘 要】
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基因工程育种克服了传统育种技术的随机性和盲目性，具有非常广阔的应用市场。尖孢镰刀菌LZ22为本实验室自筛菌株，可以将DHEA高效转化为7α，15α diOH DHEA。 课题组前期研究
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基因工程育种克服了传统育种技术的随机性和盲目性，具有非常广阔的应用市场。尖孢镰刀菌LZ22为本实验室自筛菌株，可以将DHEA高效转化为7α，15α diOH DHEA。 课题组前期研究发现CYP6003A1，CYP5057B2，CYP6002A2，CYP5255A1四个基因参与了其转化DHEA的过程。通过调研文献CYP6003A1基因是羟基脱氢酶基因，该酶是潜在的药物作用靶点。本论文主要对CYP6003A1基因进行分子克隆，并将其在酿酒酵母中表达，进而对其转化去氢表雄酮的功能进行了初步探究。 1利用RNAiso Plus法提取尖孢镰刀菌RNA，对提取的RNA进行反转录实验，利用特异性引物扩增出CYP6003A1基因序列，经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到约3459 bp的片段，目的条带清晰单一与预期片段大小一致。 2 将目的基因测序与NCBI上已经研究的不同物种的17β-羟基脱氢酶基因进行了序列比对及构建进化树。结合氨基酸序列对目的序列的蛋白质二级结构和三级结构进行了预测，为后续利用蛋白质结构生物学研究基因的功能奠定了基础。 3 构建了 CYP6003A1 基因酿酒酵母的重组表达载体，并利用重组酵母转化去氢表雄酮，同时以野生酵母以及空载体酵母作为阴性对照。结果表明 5 株重组酿酒酵母对去氢表雄酮进行转化都得到 1 个相同的主要转化产物。通过波谱解析，鉴定为 3β，17β-二羟基去氢表雄酮，转化效率最高的可达 78.87%（HPLC）。 此处为图片省略 通过本论文的研究，明确导入的CYP6003A1基因与甾体17β-羟基脱氢酶有关，可将 DHEA 转化为 3β，17β-二羟基 DHEA。但论文尚不能对 CYP6003A1基因与甾体 17β-羟基脱氢酶之间的确切联系给出准确的揭示，希望可以利用蛋白质结构生物学对基因的功能开展后续的研究。
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