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肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是各种致病因素引起肝损伤的一种修复反应,是慢性肝病发展成为肝硬化的必经途径。其主要特征是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的合成增多,降解减少,从而引起细胞间质过度沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝脏合成ECM的主要来源细胞,HSC经过活化、增殖、黏附、迁移等过程,表达各种信号转导蛋白,合成大量以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM成分和细胞因子,是肝纤维化形成的中心环节。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今为止发现的第一个具有特异性双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因。它不仅可以通过信号转导通路调控细胞的周期,抑制细胞的增殖,诱导其凋亡,还参与调节细胞的迁移、黏附。近年来,对PTEN的研究已经从肿瘤领域延伸到非肿瘤领域,成为新近研究的热点。有研究发现,PTEN基因与纤维化疾病的发生发展相关,而我们的前期研究亦表明,在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达均低于正常大鼠肝组织,并与在体HSC的活化、增殖呈显著负相关;过表达的PTEN可显著抑制体外活化HSC的增殖、诱导其凋亡,负性调控活化HSC的细胞周期进程;而低表达的PTEN可正性调控活化HSC的细胞周期进程,并引起磷酸化Akt和ERK蛋白的表达增多。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前应用的最有效的基因沉默技术,能高效特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。为此,我们在前期研究的基础上,构建了靶向PTEN的短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰重组体,并在体外感染活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6,观察阻断PTEN表达对体外活化HSC胶原代谢的影响,从反面探讨PTEN对HSC胶原代谢的影响及其机制,从而为寻求抗肝纤维化的基因治疗提供理论依据。目的:采用RNAi技术,以腺病毒为载体,构建靶向PTEN的短发卡RNA干扰重组体(PTEN shRNA),观察阻断PTEN表达对体外活化HSCⅠ、Ⅲ型胶原表达的影响,以及该过程中MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2的表达变化。方法:利用AD293T细胞扩增实验所需的腺病毒(Ad-EGFP、PTEN shRNA),并在体外感染活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6。实验分组如下:①Control组,仅以含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞,在转染步骤加入无血清无抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-EGFP组,转染表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的空病毒Ad-EGFP;③PTEN shRNA组,转染靶向PTEN的短发卡RNA干扰重组体并表达EGFP的重组腺病毒PTEN shRNA。采用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率;采用Western blot技术检测转染前后PTEN蛋白的表达;采用免疫细胞化学方法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达情况;采用Western blot技术检测转染前后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达。结果:①通过反复感染AD293T细胞的方法使病毒扩增,获得了实验所需的病毒液(Ad-EGFP、PTEN shRNA的滴度分别为1.2×109 pfu/mL、1.1×109 pfu/mL)。②应用Western blot技术分析显示,在腺病毒感染后72 h,PTEN shRNA组的PTEN蛋白表达(1.10±0.03)显著低于Control组(1.47±0.07)及Ad-EGFP组(1.38±0.08),P<0.01;而Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05)。③免疫细胞化学染色显示,在感染后72h,Ⅰ、Ⅲ型胶原在PTEN shRNA组HSC中的表达明显高于在Control组与Ad-EGFP组HSC中的表达;④应用Western blot技术分析证实,在腺病毒感染后72 h,PTEN shRNA组Ⅰ型胶原蛋白表达(0.41±0.01)显著高于Control组(0.32±0.01)及Ad-EGFP组(0.33±0.01),P<0.01;而Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05);PTEN shRNA组Ⅲ型胶原蛋白表达(0.38±0.03)高于Control组(0.29±0.03)及Ad-EGFP组(0.29±0.04),P<0.05;Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05)。⑤应用Western blot技术分析显示,在腺病毒感染后72 h,PTEN shRNA组MMP-13蛋白表达(0.41±0.02)显著低于Control组(0.66±0.04)及Ad-EGFP组(0.71±0.05),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05);PTEN shRNA组的TIMP-1蛋白表达(0.27±0.001)显著高于Control组(0.23±0.01)及Ad-EGFP组(0.22±0.01),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05)。⑥应用Western blot技术分析显示,在腺病毒感染后72 h,PTEN shRNA组MMP-2蛋白表达(0.29±0.01)显著低于Control组(0.34±0.01)及Ad-EGFP组(0.33±0.003),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05);PTEN shRNA组TIMP-2蛋白表达(1.26±0.03)高于Control组(0.96±0.01)及Ad-EGFP组(0.93±0.01),P<0.05;Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒PTEN shRNA及空病毒Ad-EGFP成功转染体外活化HSC;PTEN shRNA可有效抑制体外活化HSC中PTEN的表达,促进Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的合成,下调MMP-13和MMP-2的表达,上调TIMP-1和TIMP-2的表达。