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巨噬细胞起源于骨髓前体细胞,是广泛分布于全身的免疫细胞。巨噬细胞具有组织特异性,如肝脏中的枯否细胞、脑中的小神经胶质细胞,腹腔中的巨噬细胞、肺中的肺泡巨噬细胞以及骨中的破骨细胞等,是由巨噬细胞分别定位于不同组织而形成的。活化的巨噬细胞吞噬能力增强,可以直接通过吞噬或者通过分泌炎性细胞因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)、活性氧和NO等抗病原介质间接杀死病原体,有效防御因病原体侵害而引起的炎症反应和组织损伤,是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,在天然免疫中起重要作用。巨噬细胞在天然免疫系统中通过其表面的天然免疫识别分子(模式识别受体)特异地识别病原体的一些保守分子结构(病原体相关分子模式),从而有效地感知病原微生物的入侵并诱导机体免疫应答。细菌脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分,是导致炎症反应的主要根源之一。Toll样受体(TLRs)作为识别病原体相关分子模式的关键天然免疫受体,在宿主防御系统中发挥重要作用。LRs主要在单核细胞和树突状细胞表达。每种TLR可识别的病原分子有限,其中TLR4主要通过识别LPS并介导其信号转导而调控炎症反应,清除外来异物。柴胡为伞形科多年生草本植物,是我国传统中药,包括北柴胡(Bupleurum chinense DC)和小叶黑柴胡(Bupleurum smithii var. parvifolium),具有抗炎及免疫调节作用。其中小叶黑柴胡主要分布于我国西北地区。本实验所使用的柴胡多糖(BPs)即是从小叶黑柴胡根部提取出来的。课题组前期研究表明：(1)小鼠灌胃给予柴胡多糖可促进腹腔巨噬细胞吞噬自身凋亡细胞、抗体介导的绵羊红细胞(IgG-SRBC)和鸡红细胞(CRBC),但却抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-6和IL-1β；(2)在气管滴注LPS诱导建立的急性肺损伤(ALI)模型中,柴胡多糖能缓解肺部病理损伤,并能抑制补体过度激活和减少肺部组织中补体活化产物的沉积。鉴于以上我们已有的药效学研究成果,在本实验中,我们观察柴胡多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和分泌功能的作用,分析柴胡多糖对巨噬细胞的免疫调节作用；另外,鉴于TLR4信号转导在单核巨噬细胞发挥的重要作用,研究柴胡多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4信号通路的影响,深入探讨柴胡多糖抑制炎症反应的作用机制,以进一步了解柴胡多糖治疗ALI的可能靶点。1柴胡多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和分泌功能的调节目的研究柴胡多糖对腹腔巨噬细胞吞噬和分泌功能的作用,进而探讨其对单核巨噬细胞的免疫调节功能方法(1)BPs对巨噬细胞吞噬功能的影响：Balb/c小鼠随机分为6组,正常对照组、BPs(10、20、40、80μg/ml)处理组、地塞米松(Dex1μM)处理组。巨噬细胞给予柴胡多糖或地塞米松作用30分钟,加入FITC荧光标记的Escherichia.coli (E.coli)或者Zymosan.A(Z.A)生物颗粒与巨噬细胞共培养,检测巨噬细胞吞噬荧光颗粒的平均荧光强度并计算吞噬百分率；(2)BPs对巨噬细胞分泌功能的影响：Balb/c小鼠随机分为15组,正常对照组、BPs(10、20、40、80μg/ml)处理组、LPS(1μg/ml)刺激组、BPs各剂量与LPS联合处理组、多粘菌素B(PMB,1μg/ml)处理组、经多粘菌素B预处理的BPs各剂量组。小鼠腹腔巨噬细胞给予不同药物作用24h, Griess法和ELISA法分别检测巨噬细胞在未受刺激及受LPS刺激下,BPs对巨噬细胞分泌NO和细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p40、IL-10、IFN-β的影响。结果(1)BPs20、40、80μg/ml明显提高巨噬细胞吞噬E.coli但却显著降低其吞噬Z.A的平均荧光强度和吞噬百分率(P<0.05)。(2)BPs40、80μg/ml显著抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p40及IFN-β(P<0.05),但BPs80μg/ml却明显促进LPS诱导的巨噬细胞分泌IL-10(P<0.05)。BPs自身对巨噬细胞分泌功能的影响表现为：一方面,BPs40、80μg/ml明显促进巨噬细胞分泌TNF-α、 IL-6和IL-12p40(P<0.01),且PMB预处理能减弱但不会消除BPs对这些细胞因子的促进作用(P<0.05)；另一方面,BPs80μg/ml明显促进巨噬细胞分泌IFN-β(P<0.001),但BPs各个剂量对NO、IL-1β及IL-10的分泌均无明显影响,且PMB预处理不影响BPs对这些细胞介质的作用。结论柴胡多糖促进巨噬细胞吞噬荧光标记E.coli却抑制其吞噬荧光标记Z.A,这很可能与柴胡多糖吞噬不同异物所作用的机制和靶点不同有关；柴胡多糖抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症介质NO和促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p40但却促进抗炎细胞因子IL-10分泌,暗示了柴胡多糖对LPS诱导的TLR4信号通路下游介导炎症介质分泌的转录因子的影响；另外,柴胡多糖抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌IFN-β,而IFN-β是TLR4信号转导的MyD88非依赖途径中干扰素调节因子3(IRF3)激活而产生的细胞因子。这些结果说明柴胡多糖可能通过影响TLR4信号通路而发挥其抗炎免疫功效。再者,本实验结果表明了柴胡多糖既可抑制炎症反应却又促进病原微生物清除的免疫调节功能。2柴胡多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4信号通路的影响目的研究柴胡多糖抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的作用机制方法Balb/c小鼠随机分为6组：正常对照组、LPS(1μg/ml)刺激组、BPs(10、20、40、80μg/ml)与LPS联合处理组,观察柴胡多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4信号通路的影响。免疫荧光染色法检测BPs对LPS诱导的细胞膜上TLR4和CD14表达的影响；Western blot法检测BPs对LPS诱导的TLR4信号通路中TLR4、CD14、TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6的蛋白表达水平及NF-κB p65和MAPKs (ERK、JNK、p38)的磷酸化水平的作用。结果LPS诱导后巨噬细胞TLR4、CD14、TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6的蛋白表达水平及NF-κB p65和MAPKs的磷酸化水平显著升高(P<0.05); BPs40、80μg/ml明显抑制了LPS诱导的巨噬细胞TLR4、CD14、TLR2、IRAK4、TRAF6的蛋白表达水平及NF-κB p65和JNK的磷酸化水平(P<0.05),但BPs各个剂量组对LPS诱导的MyD88蛋白表达水平及ERK和p38磷酸化水平无明显作用。结论柴胡多糖对LPS诱导的TLR4信号通路有调节和抑制作用,主要体现在可显著降低LPS诱导的TLR4、CD14表达及NF-κB磷酸化水平增高,提示柴胡多糖很可能通过影响并抑制TLR4信号通路而发挥其抗炎免疫作用。