发育性髋脱位股骨近端骺板软骨细胞凋亡与Bcl-2、Caspase-8表达的相关性实验研究

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目的:探讨发育性髋关节脱位(DDH)股骨近端骺板软骨发育不良与细胞凋亡以及Bcl-2、Caspase-8表达之间是否存在关联性。  方法:1、选取出生4W的新西兰大耳白兔40只,雌雄不限,体重0.50±0.05kg,采用兔后肢屈髋伸膝位管型高分子塑料固定制作DDH动物模型,将实验用兔左后肢固定为实验组,右后肢不作处理作为空白对照组。固定前、固定8W及10W分别摄X线,并根据Shenton线是否连续,股骨头脱位于Perkins方格外下方或外上方来判定实验侧是否造模成功。固定8W造模成功的实验动物中,按随机数字表法,随机选取12只为8W组,剩余造模成功实验用兔继续管型高分子塑料固定2W为10W组。分批将8W组及10W组兔DDH模型采用空气栓塞法处死,处死前摄骨盆正位X线片。处死后取出股骨近端骺板软骨组织标本,进行固定、脱钙、脱水、包埋以及切片等实验操作步骤,制成5μm厚的标本切片待检。2、解剖髋关节,观察双侧髋臼及股骨头大体形态;HE染色观察各组股骨近端骺板软骨细胞病理改变;TUNEL法观察股骨近端骺板软骨细胞凋亡情况;电子显微镜观察股骨近端骺板软骨细胞超微结构特点;免疫组化法检测股骨近端骺板软骨细胞中Bcl-2和Caspase-8的表达情况。  结果:1、骨盆正位X线:8W组及10W组对照侧髋关节X表现:髋臼正常,股骨头二次骨化中心发育良好,头臼呈同心圆对位,关节间隙正常;8W组及10W组实验侧髋关节X均表现:髋臼变形,股骨头二次骨化中心发育不良,股骨头脱位于外下或外上象限,Shenton线中断。2、大体观察:8W组及10W组对照侧髋臼与股骨头外观形态基本一致,且结合紧密,髋臼呈半圆形轮廓,股骨头呈球形,圆韧带长度适宜,髋臼软骨及股骨头软骨表面光滑呈现乳白色。8W组和10W组实验侧髋臼与股骨头结合不紧密,髋臼外形呈椭圆形改变,内有软组织填充,股骨头变小变平,圆韧带拉长,关节囊松弛,髋臼软骨及股骨头软骨表面失去原有光泽,呈现黄色。3、HE染色:8W组及10W组对照侧股骨近端骺板软骨细胞大小形态均匀,排列整齐,细胞核着色浅,核仁清楚。实验侧8W组股骨近端骺板软骨细胞大小形态不一,排列稀疏紊乱,出现空泡细胞;10W组股骨近端骺板软骨细胞出现了更为明显的病理学改变,空泡细胞增多,细胞成簇聚集,空白区增多。4、TUNEL法检测8W组及10W组实验侧股骨近端骺板软骨细胞凋亡率明显高于对照侧,具有统计学意义(P<0.05);实验侧8W组及10W组细胞凋亡率无统计学意义。5、电镜观察:对照侧股骨近端骺板软骨细胞均表现为细胞形态规则,胞核规整,线粒体及内质网清晰可见且形态正常;实验侧股骨近端骺板软骨细胞均表现为细胞形态不规则、体积变小,核形不规整,线粒体数目增加且轻度肿胀,内质网轻度扩张,细胞质内细胞器不易辨认且出现空泡结构。6、免疫组化:8W组和10W组实验侧股骨近端骺板软骨细胞中Bcl-2低表达于对照侧,而Caspase-8表达高于对照侧,具有统计学差异(P<0.05);实验侧8W组及10W组比较Bcl-2表达无统计学意义;实验侧8W组及10W组比较Caspase-8表达,具有统计学差异(P<0.05)。Caspase-8呈现高表达,Bcl-2呈现低表达。  结论:1、DDH股骨近端骺板软骨细胞出现异常的病理改变。2、DDH股骨近端骺板软骨细胞存在异常的凋亡。3、Bcl-2,Caspase-8可能参与DDH股骨近端骺板软骨细胞凋亡的调控。4、通过对股骨近端骺板软骨细胞凋亡及其相关因子的适当调控,可能成为防治DDH股骨近端骺板软骨发育不良的潜在途径。
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