论文部分内容阅读
大菱鲆是我国重要的水产养殖经济鱼类,由于蛋白含量高、脂肪含量低及味道鲜美等优点受到消费者青睐。然而其在贮藏过程中极易发生腐败变质,导致食用品质及经济价值大大降低。研究发现,微生物的生长代谢是导致水产品腐败变质的主要原因,而群体感应(Quorum sensing,QS)系统作为细菌间信息交流方式能够调节微生物的腐败表型。基于干扰QS系统策略,利用群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitors,QSIs)抑制水产品腐败微生物的致腐特性,为水产品保鲜提供了新途径。但是寻找QSIs的传统方法是随机的、耗时的、低效的,且一些已报道的QSIs抑制机理尚不明确。因此,本文以大菱鲆源温和气单胞菌(Aeromonas sobria)群体感应调控基因luxI/R为研究对象,通过同源建模、虚拟筛选、分子对接等方法更加高效地寻找具有潜力的新型QSIs,并对QSIs的抑制效果及机理进行探究,旨在深层次探究水产品腐败菌的QS机制及QSI邻氨基苯甲酸甲酯的抑制机理,为建立靶向控制QS系统为基础的水产品保鲜新技术提供实验依据。主要结论如下:1.利用分子生物学方法筛选与验证温和气单胞菌中QS调控基因luxI/R,通过生物信息学对基因编码的蛋白序列进行分析可知,LuxI蛋白相对分子质量为24585.16,理论pI为6.80,LuxR蛋白相对分子质量为29371.72,理论pI为5.51。功能位点分析显示LuxI/R蛋白分别具有自诱导剂合成酶特征结构及HTH特征结构。二级结构预测结果表明两者具有明显的构象差异,且LuxR蛋白可能具有更复杂的高级结构和功能。2.采用荧光定量PCR技术探究不同环境条件对大菱鲆源温和气单胞菌luxI/R基因表达情况的影响。结果发现,适当低温(15℃)及弱碱(pH=8)条件有利于luxI/R基因表达,而高温(37℃)及强酸碱性(pH=5或9)使两基因表达受到抑制。此外,随着NaCl浓度升高,两基因表达量呈下降趋势。3.通过同源建模获得LuxI/R受体蛋白的3D模型,利用QMEAN评分函数和拉式构象图进行评价。以LuxI/R蛋白作为受体靶点,利用虚拟筛选技术从传统中药数据库中筛选出具有潜力的QSI,并验证其QS抑制活性。结果发现,对于LuxI和LuxR蛋白,分别筛选到14个和16个小分子物质。经QS抑制活性验证发现,邻氨基苯甲酸甲酯、香兰素、辣椒素及1,10-癸二醇具有较强的抗QS活性。4.采用GC-MS、RTq-PCR及分子对接等技术探究成本低、安全且有效的邻氨基苯甲酸甲酯对温和气单胞菌QS现象及其腐败活性的抑制作用。结果发现,邻氨基苯甲酸甲酯对温和气单胞菌中QS调控表型具有显著的抑制作用,包括生物膜形成、细菌运动性和蛋白酶活性。RTq-PCR和GC-MS结果表明,当不同亚抑菌浓度的邻氨基苯甲酸甲酯处理时,QS相关基因的表达水平下调,且AHL生物合成水平降低。分子对接结果表明,邻氨基苯甲酸甲酯的QS抑制机理与受体蛋白竞争性结合有关。